自噬在斑馬魚細(xì)胞冷應(yīng)激過程中的作用機(jī)制研究.pdf

1、自噬（Autophagy，自體吞噬）是指吞噬細(xì)胞內(nèi)蛋白或細(xì)胞器并進(jìn)行降解的過程。當(dāng)生物應(yīng)對(duì)不良環(huán)境（如：營(yíng)養(yǎng)缺乏等）時(shí)，可以通過分解細(xì)胞內(nèi)一些非重要的蛋白及細(xì)胞器來維持細(xì)胞的存活。也有報(bào)道當(dāng)負(fù)面的影響因素持續(xù)存在時(shí)，自噬過強(qiáng)則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡或者壞死。雖然自噬的機(jī)制和作用研究已經(jīng)有大量報(bào)道，但是自噬的這種機(jī)制應(yīng)用于南極魚類抗寒抗凍方面的研究卻甚少，探討魚類抗寒抗凍與自噬之間的相關(guān)性是研究魚類抗寒機(jī)制的一個(gè)新領(lǐng)域，對(duì)于更全面地研究魚類抗

2、寒機(jī)制有著重要意義。
　　本研究通過在細(xì)胞中過表達(dá)自噬特異性標(biāo)志物GFP- LC3（微管相關(guān)蛋白1輕鏈3，microtubule-associated protein1 light chain3）以觀察低溫環(huán)境下自噬的發(fā)生來探討自噬與細(xì)胞抗寒的關(guān)系。運(yùn)用pEGFP-LC3、mCherry-hLC3B-pcDNA3.1重組質(zhì)粒用于表達(dá)融合蛋白GFP-LC3及mChenry-LC3，并將其轉(zhuǎn)染于斑馬魚胚胎成纖維樣 ZF4細(xì)胞中，分別設(shè)

3、正常與低溫處理兩組；低溫處理后多個(gè)觀察點(diǎn)顯微鏡下觀察野生型細(xì)胞低溫處理與正常培養(yǎng)細(xì)胞的自噬小體形成的情況，與溶酶體共定位排除了由于低溫造成膜流動(dòng)性變差引起的熒光點(diǎn)聚集，證明了低溫能夠誘導(dǎo)ZF4細(xì)胞發(fā)生自噬。對(duì)低溫處理24 h的ZF4細(xì)胞內(nèi)的自噬上游調(diào)控基因beclin1與標(biāo)記基因LC3進(jìn)行RT-QPCR檢測(cè)，證明低溫可以引起細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，對(duì)低溫下處理1-13 d的ZF4細(xì)胞內(nèi)的LC3蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)，發(fā)

4、現(xiàn)低溫脅迫下，細(xì)胞內(nèi)LC3I轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)C3II的進(jìn)程加快，且10℃處理下的細(xì)胞內(nèi)的這個(gè)過程較18℃明顯快速，證明了冷刺激下細(xì)胞內(nèi)自噬的發(fā)生。對(duì)低溫脅迫下細(xì)胞內(nèi)的自噬水平以及細(xì)胞的存活率進(jìn)一步的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)顯示：不同程度的急性冷刺激下，ZF4細(xì)胞內(nèi)的自噬出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，其上調(diào)程度與低溫脅迫程度密切相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ZF4細(xì)胞自噬出現(xiàn)的時(shí)間與開始死亡的時(shí)間之間似乎有著一定的聯(lián)系。為了知道自噬在細(xì)胞受到急性冷刺激后的作用機(jī)制，通過bafilomyc

5、in A1對(duì)自噬進(jìn)行特異性的阻斷并給予急性冷刺激，存活率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)自噬特異性阻斷后，細(xì)胞的存活率顯著下降。隨后，我們?cè)O(shè)計(jì)了自噬上游基因beclin1的shRNA，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的beclin1基因進(jìn)行敲降并給予冷刺激下，存活率檢測(cè)顯示，急性冷刺激下，自噬被抑制的ZF4細(xì)胞的存活率較野生型明顯降低，證明了急性冷刺激下自噬對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證低溫刺激下自噬的功能，過表達(dá)beclin1后給予細(xì)胞不同程度的低溫刺激并統(tǒng)計(jì)其存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

6、過表達(dá)beclin1的ZF4細(xì)胞的存活率明顯上調(diào)，即自噬上調(diào)的細(xì)胞有更強(qiáng)的低溫耐受力，證明了自噬在低溫下對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　基于已發(fā)現(xiàn)的饑餓條件下自噬與ROS之間的關(guān)系，通過探討低溫下自噬與ROS之間的關(guān)系，來了解低溫下自噬的發(fā)生機(jī)制及作用功能。在急性冷刺激下，用藥物NAC(N-乙?；?L-半胱氨酸)清除細(xì)胞內(nèi)ROS(活性氧)后監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)的自噬情況，發(fā)現(xiàn)ROS清除后，細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)不到自噬小體的發(fā)生，即低溫刺激下細(xì)胞內(nèi)的自噬是由R

7、OS誘導(dǎo)的。bafilomycin A1阻斷低溫脅迫下細(xì)胞內(nèi)的自噬，并用DCFH-DA染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，結(jié)果顯示，自噬被阻斷后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平明顯上調(diào)，即自噬參與了低溫下細(xì)胞內(nèi)ROS的清除，綜上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在急性冷刺激下，ZF4細(xì)胞內(nèi)的自噬與ROS為負(fù)反饋調(diào)節(jié)模式，ROS誘導(dǎo)ZF4細(xì)胞發(fā)生自噬，自噬則反過來清除細(xì)胞內(nèi)的ROS。鑒于ROS來源于受損傷的線粒體，而ROS又與自噬相互作用，為了了解自噬與線粒體之間的關(guān)系

8、，對(duì)低溫下自噬小體與線粒體進(jìn)行共定位并給予低溫刺激，發(fā)現(xiàn)斑馬魚內(nèi)的自噬小體與線粒體發(fā)生了一定程度的共定位，說明低溫下，自噬參與了損傷線粒體的清除。將低溫脅迫下的細(xì)胞用藥物bafilomycin A1對(duì)自噬進(jìn)行阻斷，對(duì)線粒體進(jìn)行mitotracker染色并經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)自噬阻斷后，細(xì)胞內(nèi)的線粒體含量明顯較未阻斷的細(xì)胞上調(diào)，進(jìn)一步證明了自噬小體清除線粒體的作用。
　　綜上，本研究證明了低溫可以誘導(dǎo)ZF4細(xì)胞內(nèi)的線粒體發(fā)生損傷并