溶酶體在鎘誘導(dǎo)WRL-68細(xì)胞自噬過(guò)程中作用的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室已有研究證明:低濃度鎘(cadmium，Cd;＜10μM)可以誘導(dǎo)WRL-68細(xì)胞自噬，并不誘導(dǎo)WRL-68細(xì)胞凋亡。雖然目前已明確溶酶體參與細(xì)胞自噬，但是鎘誘導(dǎo)WRL-68細(xì)胞自噬過(guò)程中溶酶體功能活性是如何被調(diào)控的尚不明確。本研究旨在探究鎘誘導(dǎo)WRL-68細(xì)胞自噬過(guò)程中影響溶酶體功能活性的主要因素。首先分析鎘誘導(dǎo)WRL-68細(xì)胞自噬過(guò)程中溶酶體的活性;其次分析WRL-68細(xì)胞自噬過(guò)程中溶酶體的功能活性與自噬體-溶酶體融合的關(guān)系

2、;然后分析溶酶體酸性與溶酶體功能活性的關(guān)系;最后分析胞內(nèi)鈣離子濃度與溶酶體功能活性之間的關(guān)系。
　　本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、透射電子顯微鏡、Western blot、激光共聚焦和熒光顯微鏡等細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過(guò)對(duì)低濃度鎘（＜10μM）誘導(dǎo)WRL-68細(xì)胞自噬過(guò)程中LC3B-Ⅱ/Ⅰ和Cathepsin L表達(dá)量分析與LAMP2與GFP-LC3共定位分析來(lái)研究溶酶體功能活性在鎘誘導(dǎo)WRL-68細(xì)胞自噬過(guò)程的作用。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:

3、r>　　1.鎘誘導(dǎo)WRL-68細(xì)胞自噬過(guò)程中溶酶體活性分析
　　WRL-68細(xì)胞暴露于低濃度CdCl2（＜10μM）12h，引起細(xì)胞自噬。將WRL-68細(xì)胞暴露于低濃度鎘后，WRL-68細(xì)胞形態(tài)基本完好，但發(fā)生自噬。在透射電子顯微鏡鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)自噬泡增加;然而當(dāng)加入自噬抑制劑3-MA后，檢測(cè)到Cathepsin L和LC3B-Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達(dá)水平降低。由此得出WRL-68細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成影響著溶酶體的功能活性，抑制自噬體形成

4、時(shí)，溶酶體的活性也下降。
　　2.溶酶體功能活性與自噬體-溶酶體融合關(guān)系分析
　　WRL-68細(xì)胞暴露于低濃度鎘發(fā)生自噬，同時(shí)自噬體溶酶體融合增加;但聯(lián)合加入TG時(shí)，自噬體溶酶體融合減少。加入TG后降低了Cathepsin L的表達(dá)量，LAMP2與GFP-LC3的共定位明顯減少，但LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)量卻增加。因此溶酶體的活性依賴于自噬體和溶酶體的融合，當(dāng)抑制WRL-68細(xì)胞內(nèi)自噬體-溶酶體的融合，溶酶體活性降低。

5、　　3.溶酶體酸性與溶酶體的功能活性關(guān)系分析
　　WRL-68細(xì)胞暴露于低濃度鎘誘導(dǎo)發(fā)生自噬。用LysoTracker Red染色，當(dāng)WRL-68細(xì)胞中加入Cd時(shí)，LysoTracker染色增加，說(shuō)明溶酶體酸性增加;但聯(lián)合加入CQ時(shí)，LysoTracker染色減少，說(shuō)明溶酶體酸性降低。加入CQ后，Cathepsin L的表達(dá)量降低，但LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)量增加，LAMP2與GFP-LC3共定位卻減少。因此在WRL-68細(xì)胞中溶酶體

6、的功能活性與溶酶體的酸性有關(guān)，當(dāng)溶酶體的酸性降低時(shí)，溶酶體的功能活性也隨之下降。
　　4.胞內(nèi)鈣離子濃度與溶酶體功能活性關(guān)系分析WRL-68細(xì)胞暴露于低濃度鎘發(fā)生自噬。當(dāng)WRL-68細(xì)胞暴露于8μM Cd時(shí)，LysoTracker熒光強(qiáng)度增加，聯(lián)合加入CQ時(shí)熒光強(qiáng)度降低，然而在聯(lián)合加入2-APB時(shí)熒光強(qiáng)度并沒(méi)有多大的變化。在聯(lián)合加入CQ或2-APB時(shí)胞內(nèi)鈣離子濃度降低GFP-LC3與LAMP2融合也減少。酸性、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和

7、Cathepsin L的表達(dá)量降低，LAMP2與GFP-LC3的共定位也明顯減少，但LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)量增加。在WRL-68細(xì)胞中溶酶體的功能活性與胞內(nèi)Ca2+之間會(huì)相互影響，溶酶體的酸性對(duì)胞內(nèi)Ca2+的濃度水平影響較大，而胞內(nèi)Ca2+濃度對(duì)溶酶體的酸性影響較小。
　　本研究在WRL-68細(xì)胞暴露于低濃度Cd（＜10μM）發(fā)生自噬。細(xì)胞自噬過(guò)程中溶酶體功能活性增強(qiáng)，且自噬體-溶酶體融合、溶酶體的酸性和細(xì)胞內(nèi)鈣離子都會(huì)影響溶酶體的