氧化應(yīng)激介導(dǎo)的自噬在鎘誘導(dǎo)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中作用機(jī)制的研究.pdf

1、鎘(Cadmium)是一種廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的有毒重金屬，隨著近年來越來越多有關(guān)鎘污染的報(bào)道，人們也越來越關(guān)注鎘對(duì)環(huán)境和人類的健康造成的影響。鎘能對(duì)多個(gè)器官系統(tǒng)造成巨大的危害，包括腎、肝、腦、肺、睪丸及血液等。流行病學(xué)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中明確了鎘暴露與多種腫瘤有相關(guān)性，尤其是鎘與肺癌有明顯的關(guān)聯(lián)性，1993年IARC（國際腫瘤研究中心）將鎘列為Ⅰ類致癌物。研究表明，許多癌癥和腫瘤晚期的轉(zhuǎn)移和惡化可能與腫瘤細(xì)胞自噬水平改變有關(guān)。自噬通過

2、包裹細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)和衰老細(xì)胞器形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體進(jìn)行降解物質(zhì)實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用，這一過程受自噬相關(guān)蛋白(Atg)的逐級(jí)調(diào)節(jié)，隨后自噬體與溶酶體融合后消化膜內(nèi)容物產(chǎn)生合成大分子和代謝物的物質(zhì)，為細(xì)胞提供能量來源。因此，本研究擬探討低濃度鎘誘導(dǎo)的自噬在鎘誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生中的可能分子機(jī)制。
　　本研究擬以人肺腺癌A549細(xì)胞為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察氯化鎘對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;再通過觀察細(xì)胞周期改變及Cycli

3、n-D1表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，自噬形成及相關(guān)蛋白的表達(dá)、細(xì)胞遷移侵襲能力變化及相關(guān)蛋白MMP-9蛋白表達(dá)，探討可能的分子機(jī)制;并采用活性氧(ROS)的清除劑N-乙酰半胱氨酸NAC和Atg4 siRNA干預(yù)處理，進(jìn)一步明確ROS上調(diào)Atg4引起的自噬在氯化鎘誘導(dǎo)A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和侵襲中的分子機(jī)制，為鎘誘導(dǎo)腫瘤提供預(yù)防和治療的理論依據(jù)。
　　目的:研究低濃度氯化鎘對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖、細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

4、，并探討依賴細(xì)胞內(nèi)ROS的自噬途徑在細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和侵襲變化過程中的作用機(jī)制。
　　方法:以人肺腺癌細(xì)胞(A549細(xì)胞)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將不同濃度氯化鎘作用于A549細(xì)胞，應(yīng)用MTT法測(cè)定A549細(xì)胞增殖率和不同實(shí)驗(yàn)干預(yù)劑NAC、3-MA和Atg4 siRNA預(yù)處理后氯化鎘作用于A549細(xì)胞增殖率的變化。分別采用透射電鏡和熒光顯微鏡測(cè)定A549細(xì)胞的自噬水平和自噬溶酶體膜電位的變化。用熒光顯微鏡觀察經(jīng)Cyto-ID(

5、R)Green染色的自噬小體綠色熒光強(qiáng)度的改變。用2'，7'-二氯熒光素二乙酸鹽(DCFH—DA)染色法，在熒光顯微鏡下觀察氯化鎘處理后A549細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量的變化，并用NAC預(yù)處理2小時(shí)，以明確細(xì)胞內(nèi)ROS在氯化鎘誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和增殖中的作用。應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氯化鎘作用后A549細(xì)胞的遷移和侵襲的能力改變。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中不同實(shí)驗(yàn)處理組A549細(xì)胞生長周期的變化。運(yùn)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，敲除A

6、549細(xì)胞自噬相關(guān)基因4(ATG4)，檢測(cè)氯化鎘所誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。用蛋白印跡法(Westem Blot)檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)中自噬標(biāo)志蛋白LC3蛋白、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和Atg4蛋白、細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1以及MMP-9蛋白的表達(dá)量。用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:低濃度氯化鎘作用A549細(xì)胞48小時(shí)后，誘導(dǎo)A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖(P＜0.01)，細(xì)胞周期結(jié)果顯示氯

7、化鎘處理組S期和G2/M期細(xì)胞百分比例顯著增加，G0/G1期細(xì)胞比例減少(P＜0.05)。電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示形成自噬小體數(shù)量增加，熒光顯微鏡觀察經(jīng)Cyto-ID(R)Green染色的A549細(xì)胞自噬小體熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量增加，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低濃度（2μM）氯化鎘作用于A549細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，NAC預(yù)處理降低了氯化鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高，表明氯化鎘引起了A549細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)，NAC可

8、以有效的抑制氯化鎘的促增殖作用和下調(diào)由氯化鎘誘導(dǎo)表達(dá)增加的自噬相關(guān)蛋白LC3和Atg4的表達(dá)量，表明氯化鎘通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬和細(xì)胞增殖；自噬抑制劑3-MA和Atg4 siRNA不僅能夠拮抗氯化鎘作用誘導(dǎo)的自噬增加效應(yīng)，還抑制了氯化鎘對(duì)A549細(xì)胞的促增殖、遷移和侵襲能力，表明Atg4介導(dǎo)的自噬在氯化鎘誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮了重要作用。
　　結(jié)論:低濃度氯化鎘通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高、上調(diào)