MACF1在自噬促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤遷移和侵襲中的作用.pdf

1、膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)惡性腫瘤，約占所有顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤的70％。在膠質(zhì)瘤的WHO分型中，Ⅳ型膠質(zhì)瘤，即膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GlioblastomaMultiforme，GBM）惡性程度最高，具有相當(dāng)高的復(fù)發(fā)率和致死性。目前臨床上針對GBM普遍采用包含最大安全范圍手術(shù)切除+替莫唑胺(temozolomide，TMZ)化療+放療的綜合治療方案（STUPP方案），但GBM患者預(yù)后仍很差，平均中位生存期只有15個月左右，2年生存率為27

2、％。GBM在經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)方案治療后仍然復(fù)發(fā)并向周圍組織侵襲是導(dǎo)致患者預(yù)后差的主要原因之一。GBM在其進(jìn)展過程中出現(xiàn)的局部缺血缺氧及化療藥物TMZ的刺激作用等可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。另外上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認(rèn)為是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤（包括GBM）細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。
　　在本研究前期實驗中，我們已證實TMZ可誘導(dǎo)G

3、BM發(fā)生自噬，并進(jìn)而誘導(dǎo)GBM發(fā)生EMT，獲得遷移和侵襲能力。另外，我們發(fā)現(xiàn)TMZ可以顯著上調(diào)微管微絲交連蛋白(microtubule-actin crosslinking factor1，MACF1，也稱之為ACF7)的表達(dá)水平，而MACF1已在小鼠上皮組織中被證實與細(xì)胞遷移相關(guān)。因此，我們提出假說，TMZ等刺激作用通過誘導(dǎo)GBM發(fā)生自噬，進(jìn)而誘導(dǎo)其MACF1表達(dá)水平上調(diào)，從而導(dǎo)致GBM發(fā)生EMT并獲得遷移和侵襲能力。在本研究中，我們

4、在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87和U251細(xì)胞上對此假說進(jìn)行了探索。
　　第一章 MACF1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的生物功能的初步研究
　　方法:分別應(yīng)用siRNA干擾序列和慢病毒載體干擾U87和U251中MACF1的表達(dá)，并用RT-PCR和Western Blot檢測干擾效率。通過細(xì)胞計數(shù)、CCK8實驗、細(xì)胞形態(tài)觀察、劃痕實驗、Transwell小室遷移實驗、Boyden小室侵襲實驗、Western Blot和免疫熒光等實驗，檢測干擾

5、MACF1后的U87和U251細(xì)胞的細(xì)胞表型和功能上的差異。
　　結(jié)果:干擾U87和U251中MACF1的表達(dá)后，細(xì)胞增殖無明顯差異(P＞0.05);細(xì)胞胞體長徑變短，細(xì)胞凸起減少變短;細(xì)胞遷移能力下調(diào)(P＜0.001)，侵襲能力下調(diào)(P＜0.05);在EMT相關(guān)蛋白中，上皮細(xì)胞表型標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)記物表達(dá)下調(diào)，EMT轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下調(diào)。
　　第二章 自噬誘導(dǎo)U87細(xì)胞MACF1表達(dá)水平上調(diào)
　　方法:分別

6、用含雷帕霉素（rapamycin，RAPA，自噬誘導(dǎo)劑）和TMZ和氯喹（chloroquine，CQ，自噬抑制劑）的完全培養(yǎng)基持續(xù)作用于U87細(xì)胞，通過Western Blot檢測各組MACF1表達(dá)水平。
　　結(jié)果:RAPA和TMZ持續(xù)刺激U87細(xì)胞后，MACF1表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.01)。通過CQ抑制自噬以后再用RAPA和TMZ刺激U87細(xì)胞，其MACF1表達(dá)水平相比未抑制自噬的細(xì)胞明顯下調(diào)(P＜0.05)，證實通過在U8

7、7膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬流水平上調(diào)可誘導(dǎo)MACF1表達(dá)水平上調(diào)。
　　第三章 MACF1在自噬促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤遷移和侵襲中的作用
　　方法:應(yīng)用慢病毒載體穩(wěn)定干擾U87中MACF1的表達(dá)后，對U87細(xì)胞用RAPA誘導(dǎo)自噬流水平上調(diào)，并采用Transwell小室遷移實驗、Boyden小室侵襲實驗檢測對干擾MACF1后的U87細(xì)胞誘導(dǎo)自噬流水平上調(diào)后其細(xì)胞遷移和侵襲的差異。
　　結(jié)果:對未干擾MACF1表達(dá)的正常對照組