Toll樣受體2在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲遷移中的作用及其機(jī)制探討.pdf

1、膠質(zhì)瘤是人類中樞系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，約占40-60%，局部浸潤(rùn)性生長(zhǎng)是其最重要的生物學(xué)特性。目前臨床治療手段主要是手術(shù)最大程度切除腫瘤后進(jìn)行輔助放、化療，但是治療效果卻十分不理想。臨床治療失敗最根本的原因是膠質(zhì)瘤向正常腦組織的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)影響手術(shù)切除程度的精確判斷。因此，對(duì)于膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)生物學(xué)機(jī)制的研究尤為重要。
　　 既往對(duì)于Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)功能的研究主要集中在其介導(dǎo)天

2、然免疫及獲得性免疫中發(fā)揮的作用這兩方面，近些年研究發(fā)現(xiàn)TLRs同樣表達(dá)于某些腫瘤細(xì)胞，且對(duì)腫瘤的發(fā)展和演進(jìn)發(fā)揮重要作用。腫瘤演進(jìn)是一個(gè)涉及腫瘤和宿主多方面的復(fù)雜相互作用的過(guò)程。其中，腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、運(yùn)動(dòng)遷移能力、蛋白水解酶釋放等發(fā)生改變均為十分重要的研究?jī)?nèi)容。
　　 最初發(fā)現(xiàn)Toll蛋白表達(dá)于果蠅體內(nèi)，是物種進(jìn)化保留下來(lái)的保守序列。TLRs為一類病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular p

3、atterns，PAMPs)，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，是白介素1受體(Interleukin1 receptor，IL-1R)超家族成員，胞外區(qū)是富含亮氨酸的重復(fù)序列，胞內(nèi)區(qū)是結(jié)構(gòu)保守的Toll/IL-1受體同源區(qū)(Toll/IL-1 receptorhomologous region，TIR)。迄今為止，在人類和小鼠分別發(fā)現(xiàn)10種和12種功能TLRs，TLR1-TLR9在人類和小鼠細(xì)胞均有表達(dá)；小鼠TLR10由于反轉(zhuǎn)錄病毒插入而失去功能，但

4、卻發(fā)現(xiàn)了人類細(xì)胞不表達(dá)的TLR11、TLR12和TLR13。最初發(fā)現(xiàn)TLRs在人體內(nèi)廣泛表達(dá)于樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，但近年來(lái)的研究表明，TLRs的表達(dá)不僅局限于免疫細(xì)胞，同樣表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　 近年提出的“腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSCs)”理論認(rèn)為，腫瘤中存在少量具有自我更新，多向分化潛能及啟動(dòng)與重建腫瘤組織表型能力的細(xì)胞。但是，這些CSCsTLRs的

5、表達(dá)情況，及其對(duì)于腫瘤發(fā)展演進(jìn)的作用與機(jī)制尚未見明確報(bào)道。
　　 已有文獻(xiàn)報(bào)道，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL261表達(dá)TLRs，但是表達(dá)于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Gliomastem cells，GSCs)的TLRs究竟發(fā)揮何種生物學(xué)作用及其可能機(jī)制需要進(jìn)一步探討。為了確定膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261上TLRs表達(dá)情況，以及探討其是否在GSCs侵襲及遷移中發(fā)揮作用，我們首先對(duì)小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞上TLRs表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，然后進(jìn)一步檢測(cè)TLR2的表達(dá)對(duì)于GSCs侵襲遷

6、移能力的影響，及人工合成配體Pam3CS K4激活腫瘤細(xì)胞TLR2后，細(xì)胞在mRNA水平表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase，MMP2)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)的變化情況，我們還觀察了TLR2對(duì)于荷瘤小鼠生存時(shí)間及腫瘤細(xì)胞向鄰近正常組織浸潤(rùn)程度的影響。主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1.小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261表達(dá)TLRs，經(jīng)過(guò)干性鑒定的GSCs較GL261細(xì)胞侵襲及遷移能力更強(qiáng)，且與GL

7、261細(xì)胞相比，GSCs在mRNA和蛋白質(zhì)水平TLR2表達(dá)更高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GL261在mRNA水平表達(dá)多種TLRs，其中TLR2高表達(dá)，TLR3表達(dá)水平較高，TLR1、TLR5、TLR7和TLR11則幾乎不表達(dá)。運(yùn)用無(wú)血清條件培養(yǎng)基成球培養(yǎng)富集細(xì)胞球，并運(yùn)用免疫熒光染色對(duì)其干性進(jìn)行鑒定，觀察發(fā)現(xiàn)干性標(biāo)記Nestin、Oligo2及Sox2均強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。運(yùn)用半定量、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blotting的方

8、法，從mRNA及蛋白質(zhì)水平證實(shí)，與GL261細(xì)胞相比，GSCs高表達(dá)TLR2。運(yùn)用Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)GSCs侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)分別為GL261細(xì)胞的1.55倍和1.68倍(p<0.05)。
　　 2.Pam3CSK4可以通過(guò)激活小鼠GSCs TLR2以增強(qiáng)其侵襲及遷移能力，其可能機(jī)制為Pam3CSK4使GSCs上調(diào)表達(dá)MMP2和MMP9。用1μg/ml的TLR2激動(dòng)劑Pam3CSK4作用于GSCs48h后，tra

9、nswell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)分別為對(duì)照組細(xì)胞數(shù)的2.23和2.28倍(p<0.05)。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blotting測(cè)定，慢病毒穩(wěn)定干擾TLR2基因表達(dá)后，Pam3CSK4促進(jìn)細(xì)胞侵襲及遷移的作用消失。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果證實(shí)激活TLR2可引起GSCs上調(diào)表達(dá)MMP2和MMP9，分別以4h和6h時(shí)最顯著，而TLR2沉默表達(dá)后，此效應(yīng)消失。
　　 3.TLR2表達(dá)對(duì)體內(nèi)成瘤的影響。沉默表