抑制小膠質(zhì)細(xì)胞MT1-MMP表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲和遷移的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 長(zhǎng)期以來(lái)中樞神經(jīng)系統(tǒng)被認(rèn)為是一個(gè)免疫特免器官，缺少外周免疫細(xì)胞、與免疫相關(guān)的部分細(xì)胞因子及血漿蛋白。然而1964年Scheinberg等的腦腫瘤移植實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，移植部位周圍有輕度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及小膠質(zhì)細(xì)胞增生，提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)并非絕對(duì)免疫特免器官。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫監(jiān)督中具有關(guān)鍵作用，但近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞還與膠質(zhì)瘤的發(fā)展密切相關(guān)。
　　 腦膠質(zhì)瘤是人神經(jīng)系統(tǒng)

2、中發(fā)病率最高、惡性程度最高、預(yù)后最差的一種惡性腫瘤。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，雖然目前膠質(zhì)瘤的診斷和治療方法有了較大的進(jìn)步，但療效尚不令人滿意，大部分惡性膠質(zhì)瘤病人生存期在一年以內(nèi)。早在1925年，Wilder通過(guò)對(duì)腦膠質(zhì)瘤組織銀染色觀察，第一次詳細(xì)地描述了膠質(zhì)瘤組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的存在。腦膠質(zhì)瘤被證明具有免疫原性，但奇怪的是在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中并未發(fā)現(xiàn)機(jī)體對(duì)腫瘤產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)。對(duì)手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組化的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤組

3、織中有大量的小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞集聚現(xiàn)象，同時(shí)還伴隨少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)于腦膠質(zhì)瘤組織中出現(xiàn)高水平的小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，目前傾向于認(rèn)為是由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中向周圍細(xì)胞微環(huán)境分泌釋放趨化分子及生長(zhǎng)因子等物質(zhì)所致。
　　 研究表明，膠質(zhì)瘤病灶中的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞及細(xì)胞碎片幾乎無(wú)吞噬現(xiàn)象出現(xiàn)。膠質(zhì)瘤相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(GIMs)盡管仍能表達(dá)Toll樣受體(TLR)，且TLR及其配體的相互作用仍存在，但是不能引起G

4、IMs激活而增強(qiáng)細(xì)胞身吞噬功能;另外，由于缺少必要的刺激分子CD80(B7-1)、CD86(B7-2)和CD40的表達(dá)，GIMs不能提供充足的刺激以激活T淋巴細(xì)胞。在對(duì)從老鼠分離培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞在受到刺激信號(hào)后并不上調(diào)第二型主要組織相容性復(fù)合體(MHC-Ⅱ)的表達(dá)，以至于小膠質(zhì)細(xì)胞所表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)不足以進(jìn)行抗原呈遞激活T淋巴細(xì)胞，而在無(wú)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的情況下小膠質(zhì)細(xì)胞可明顯的增強(qiáng)MHC

5、-Ⅱ及B7的表達(dá)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠下調(diào)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的活化小膠質(zhì)細(xì)胞分泌釋放促炎癥因子TNF-α能力。另外，膠質(zhì)瘤細(xì)胞促使活化小膠質(zhì)細(xì)胞分泌釋放白介素-10(IL-10)，后者抑制小膠質(zhì)細(xì)胞由IFN-γ誘導(dǎo)的MHC分子表達(dá)引起抗原呈遞功能下降，直接導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞難以激活T淋巴細(xì)胞。以上資料表明，由于受到膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬、抗原呈遞及分泌釋放促炎癥因子等功能的抑制，小膠質(zhì)細(xì)胞在膠質(zhì)瘤組織中不能啟動(dòng)針對(duì)癌細(xì)胞的、有效的固有性及

6、適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
　　 近期研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞與膠質(zhì)瘤微環(huán)境免疫抑制及促膠質(zhì)瘤增殖、浸潤(rùn)有密切關(guān)系。金屬蛋白酶(MMPs)所誘導(dǎo)的基質(zhì)降解機(jī)制在膠質(zhì)瘤侵襲和遷移過(guò)程中具有關(guān)鍵性的作用。MMP-2和MMP-9被認(rèn)為與腫瘤的侵襲與遷移最為密切相關(guān)，而小膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞本身均是MMPs的重要細(xì)胞來(lái)源。這些MMPs被分泌釋放入腫瘤微環(huán)境，參與降解膠質(zhì)瘤細(xì)胞外基質(zhì)，并最終為膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移過(guò)程“鋪路”。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤能夠

7、引起小膠質(zhì)細(xì)胞膜上MT1-MMP表達(dá)升高，而小膠質(zhì)細(xì)胞MT1-MMP高表達(dá)又反過(guò)來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘤所分泌釋放的pro-MMP-2激活，大量活性MMP-2被分泌釋放入膠質(zhì)瘤微環(huán)境中，最終促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲和遷移。因此，如果能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中促膠質(zhì)瘤相關(guān)MMPs的表達(dá)，則有望降低膠質(zhì)瘤侵襲和遷移的能力。
　　 阿托伐他汀是3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，一直以來(lái)作為治療心血管疾病藥物被廣泛應(yīng)用于降低血液中膽固醇含

8、量，但最近發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀具有抗腫瘤作用。在內(nèi)皮細(xì)胞及多種腫瘤中觀察到他汀類藥物對(duì)MMP-2、MMP-9和MT1-MMP的抑制作用。因此，我們選擇阿托伐他汀作為干預(yù)因素探討其是否能夠影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞之間MMPs表達(dá)及其對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲和遷移影響。
　　 方法：
　　 1、CCK-8法定量檢測(cè)梯度濃度阿托伐他汀對(duì)原代人小膠質(zhì)細(xì)胞和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性影響。
　　 2、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn):通過(guò)膠質(zhì)瘤條件培

9、養(yǎng)基(GCM)孵化小膠質(zhì)細(xì)胞，制備小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MCM)。應(yīng)用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)MCM干預(yù)下U87侵襲和遷移能力，同時(shí)使用阿托伐他汀干預(yù)GCM孵化小膠質(zhì)細(xì)胞制備MCM過(guò)程，檢測(cè)U87侵襲和遷移能力改變。
　　 3、明膠酶譜法檢測(cè)阿托伐他汀干預(yù)下U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)，及阿托伐他汀與GCM聯(lián)合干預(yù)下小膠質(zhì)細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)。
　　 4、Western

10、Blotting檢測(cè)阿托伐他汀干預(yù)下U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞MT1-MMP、P-p38 MAPK、P-ERK和P-JNK表達(dá)，及阿托伐他汀與GCM聯(lián)合干預(yù)下小膠質(zhì)細(xì)胞MT1-MMP、P-p38 MAPK、P-ERK和P-JNK表達(dá)。
　　 5、QPCR檢測(cè)阿托伐他汀干預(yù)下U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2、MMP-9和MT1-MMP相關(guān)基因表達(dá)，及阿托伐他汀與GCM聯(lián)合干預(yù)下小膠質(zhì)細(xì)胞MMP-2、MMP-9和MT1-MMP相關(guān)基因表達(dá)。

11、　　 結(jié)果：
　　 1、10-4 mol/L阿托伐他汀作用于細(xì)胞24h，U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞與和小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活力均明顯降低，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。10-10mol/L阿托伐他汀顯著增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞活力，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。10-9～10-5 mol/L各組U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞活力與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。根據(jù)結(jié)果，我們選擇藥物安全濃度內(nèi)

12、最大藥物濃度10-5 mol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度。
　　 2、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):10-5 mol/L阿托伐他汀干預(yù)24h，每400倍鏡下U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移平均數(shù)為55.7±3.0，與對(duì)照組U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移平均數(shù)63.7±3.3相比減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 MCM干預(yù)24h，U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移平均數(shù)為89.4±3.5，與對(duì)照組相比顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。阿托伐他汀MCM干預(yù)24h，U8

13、7膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移平均數(shù)為56.3±3.2，與MCM干預(yù)組比較顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn):MCM干預(yù)24h，每400倍鏡下U87細(xì)胞侵襲平均數(shù)為28.2±2.8，與對(duì)照組U87細(xì)胞侵襲平均數(shù)13.2±1.9相比顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。阿托伐他汀MCM干預(yù)24h，U87細(xì)胞侵襲平均數(shù)為11.3±1.0，與MCM干預(yù)組相比顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。10-

14、5mol/L阿托伐他汀干預(yù)24h，U87細(xì)胞侵襲平均數(shù)為10.2±3.1，與對(duì)照組相比略微減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、將樣品濃縮經(jīng)明膠酶譜法檢測(cè)U87細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中MMP-2和MMP-9表達(dá)。GCM干預(yù)24h，小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中MMP-2表達(dá)顯著升高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。10-5 mol/L阿托伐他汀+GCM聯(lián)合干預(yù)24h，小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中MMP-2表達(dá)較GCM干

15、預(yù)組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。10-5 mol/L阿托伐他汀干預(yù)24h，小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中MMP-2表達(dá)與對(duì)照組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。10-5 mol/L阿托伐他汀干預(yù)24h，小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中MMP-9表達(dá)降低，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。另外，U87細(xì)胞在阿托伐他汀中孵化24h，MMP-2表達(dá)降低。
　　 4、收集經(jīng)10-5mol/L阿托伐他汀孵化的小膠質(zhì)細(xì)

16、胞和U87細(xì)胞，檢測(cè)各組細(xì)胞中MT1-MMP、P-p38、P-JNK和P-ERK的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，GCM孵化小膠質(zhì)細(xì)胞24h，小膠質(zhì)細(xì)胞MT1-MMP表達(dá)與對(duì)照組相比顯著升高。10-5mol/L阿托伐他汀+GCM孵化小膠質(zhì)細(xì)胞24h，小膠質(zhì)細(xì)胞MT1-MMP表達(dá)較GCM干預(yù)組顯著降低。10-5mol/L阿托伐他汀干預(yù)U87細(xì)胞24h，U87細(xì)胞MTI-MMP表達(dá)與對(duì)照組相比輕微降低。小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GCM孵化12h和24h，P-p38表

17、達(dá)均較對(duì)照組顯著升高。10-5mol/L阿托伐他汀+GCM孵化小膠質(zhì)細(xì)胞12h和24h，P-p38表達(dá)分別與GCM干預(yù)12h和24h相比顯著降低，但P-JNK和P-ERK表達(dá)分別與GCM干預(yù)12h和24h相比無(wú)明顯變化。U87細(xì)胞經(jīng)10-5mol/L阿托伐他汀干預(yù)24h，U87細(xì)胞P-JNK表達(dá)較對(duì)照組降低，P-ERK和P-p38表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　 5、收集經(jīng)10-5mol/L阿托伐他汀孵化24h的小膠質(zhì)細(xì)胞和U87細(xì)胞，檢

18、測(cè)各組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和MTI-MMP相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GCM、10-5mol/L阿托伐他汀+GCM或10-5mol/L阿托伐他汀干預(yù)24h，MMP-2基因表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯變化（P＞0.05），各組間均無(wú)明顯差異(P＞0.05)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GCM孵化24h，MTl-MMP基因表達(dá)較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)10-5mol/L阿托伐他汀+GCM孵化2

19、4h，MTI-MMP基因表達(dá)與GCM干預(yù)組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。U87細(xì)胞經(jīng)10-5mol/L阿托伐他汀孵化24h，U87細(xì)胞的MMP-2、MMP-9和MTI-MMP基因表達(dá)均較對(duì)照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。
　　 結(jié)論：
　　 本研究通過(guò)模擬膠質(zhì)瘤與小膠質(zhì)細(xì)胞間相互作用，證實(shí)了阿托伐他汀通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的促腫瘤作用降低膠質(zhì)瘤的侵襲和遷移能力，并且這一作用可能是通過(guò)抑