小分子化合物水飛薊素和酮康唑?qū)δ[瘤靶點(diǎn)作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景： 惡性腫瘤已成為人類死亡的一個(gè)重要原因。近幾十年，腫瘤的手術(shù)及放化療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，腫瘤患者生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，但對(duì)大部分惡性腫瘤的治療尚未能達(dá)到令人滿意的效果。當(dāng)今抗腫瘤藥物的研制方向主要有：(1)針對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找新的分子作用(酶、受體、基因)靶點(diǎn)等；(2)尋找小分子靶向性藥物，包括從中草藥等天然產(chǎn)物和已有的化合物庫(kù)中尋找活性成分。研究環(huán)境生物因素等外因在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞分子改變事件，可為惡性腫瘤的

2、藥物治療尋找新的分子靶點(diǎn)。近來(lái)BertVogelstein等人對(duì)11個(gè)乳腺癌和11個(gè)結(jié)直腸癌進(jìn)行了DNA突變分析，發(fā)現(xiàn)其中存在著約15個(gè)主要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的失調(diào)，并啟示我們，如果通過阻斷這些通路中的始動(dòng)者“Driver”，而不是僅僅是阻斷個(gè)別的從動(dòng)者“Passenger”基因，則無(wú)論這些通路中的基因如何突變，都能起到真正抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。由此我們可以認(rèn)為，研制抑制主要通路中關(guān)鍵基因“Driver”的分子靶向藥物或多靶點(diǎn)的藥物，是靶

3、向治療今后的發(fā)展方向。Vogelstein等人的研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路是關(guān)鍵性的幾個(gè)信號(hào)通路之一。在很多人類腫瘤中普遍存在Akt的高表達(dá)，包括肝癌、白血病等，提示Akt可能是一個(gè)腫瘤預(yù)防和治療的重要靶點(diǎn)。 我國(guó)作為傳統(tǒng)中藥大國(guó)，一直以來(lái)在中成藥和天然藥物的開發(fā)和研究上具有很多的積累。中藥和天然藥物的疾病預(yù)防和治療以及保健作用比較明確，研制新藥的成功率比較高，潛力大，前景廣。由于中藥的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，從中篩選高效、低毒的單體

4、化合物用于腫瘤治療和預(yù)防已成為當(dāng)前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。在天然植物單體化合物庫(kù)中進(jìn)行篩選，篩選得到的化合物一般對(duì)人體細(xì)胞安全、低毒。 激素和生長(zhǎng)因子與其受體組成的信號(hào)通路也是腫瘤生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素。雄激素和雄激素受體(AR)對(duì)于男性生殖系統(tǒng)及其它組織器官的發(fā)育、分化，以及男性腫瘤如前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，異常的AR活性被認(rèn)為是前列腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵因素。由于雄激素受體在雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)中常擴(kuò)增和過表達(dá)，抑制AR

5、的表達(dá)可能是治療前列腺癌的一個(gè)有效方案。酮康唑(KT)常用作抗真菌藥物，已有多個(gè)臨床試驗(yàn)將其用于治療雄激素非依賴性前列腺癌，并能顯著抑制PSA水平和改善病人生活質(zhì)量。但其在體外對(duì)前列腺癌細(xì)胞的直接作用機(jī)理不明。 研究目的： 揭示正常上皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的信號(hào)通路改變，并研究小分子化合物水飛薊素和酮康唑?qū)δ[瘤細(xì)胞不同信號(hào)通路Akt和雄激素受體AR的作用機(jī)制，從而為臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。 研究結(jié)果： 本論文主

6、要研究結(jié)果如下： 1微囊藻毒素誘導(dǎo)大腸Crypt細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制1.1轉(zhuǎn)化細(xì)胞MTC中Akt，MAPK信號(hào)通路激活微囊藻毒素為我國(guó)特有的環(huán)境生物因素，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)微囊藻毒素作用的永生化正常大腸Crypt細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞克隆，發(fā)生細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 用基因芯片技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)Akt通路的多個(gè)基因發(fā)生上調(diào)，包括MAPKAPK2，Akt，HER2，cyclinD1和cyclinD3上調(diào)大于兩倍，PI3K上調(diào)大于1.5倍。W

7、esternblot結(jié)果顯示，微囊藻毒素轉(zhuǎn)化MTC細(xì)胞中Akt，cyclinD1，cyclinD3和HER2蛋白表達(dá)量比正常對(duì)照大腸Crypt(NCC)細(xì)胞明顯增高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MTC細(xì)胞中PI3K，Akt和MAPKAPK2酶活性較NCC細(xì)胞明顯提高。 除了Akt信號(hào)通路異常激活外，基因芯片結(jié)果顯示，MTC細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路也存在上調(diào)，多個(gè)MAPK通路相關(guān)基因上調(diào)大于兩倍，包括R-Ras，B-Raf，JNK1，JNK2和

8、p38等，而Erk1/2MAPK都沒有明顯改變。Westernblot結(jié)果顯示MTC細(xì)胞中p38和JNK蛋白顯著上調(diào)，p38和JNK激酶總活性也明顯升高。1.2Akt，p38和JNK信號(hào)通路的持續(xù)性激活可能是細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原因以及有效的腫瘤治療靶點(diǎn)Akt，p38和JNK信號(hào)通路在MTC細(xì)胞中持續(xù)激活，具體表現(xiàn)為21代和30代MTC細(xì)胞中的酶活性與15代細(xì)胞沒有明顯差異，且均顯著高于NCC細(xì)胞。用Akt酶的抑制劑17-AAG50nM和p38酶

9、抑制劑SB20358010nM顯著抑制了MTC細(xì)胞的增殖活性，抑制率分別達(dá)42％和33％(與DMSO對(duì)照組相比P<0.01)，同樣的，10nM的JNK酶抑制劑SP600125也顯示出了很強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用(P<0.05)，而聯(lián)用17-AAG和SB203580能更強(qiáng)烈的抑制細(xì)胞增殖。這些結(jié)果提示Akt，p38和JNK的酶活性可能是微囊藻毒素引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化所需，這些信號(hào)通路可能是微囊藻毒素誘導(dǎo)腸上皮癌變的治療靶點(diǎn)。 2水飛薊素是有效

10、的Akt酶抑制劑2.1多種中藥單體對(duì)腫瘤細(xì)胞的Akt活性影響選用9種中藥化合物，體外篩選Akt酶抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水飛薊素，辣椒素，和厚樸酚以及兒茶素能明顯下調(diào)腫瘤細(xì)胞Akt酶活性。進(jìn)一步用Westernblot研究發(fā)現(xiàn)，用10，50，100ug/ml水飛薊素處理K562細(xì)胞，Akt磷酸化被顯著抑制，而且呈濃度依賴性，而Akt總蛋白沒有明顯改變，提示水飛薊素可能是通過影響Akt蛋白翻譯后修飾而影響其磷酸化。 2.2水飛薊素對(duì)K5

11、62細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用K562細(xì)胞經(jīng)過不同濃度水飛薊素作用48小時(shí)后，較低濃度水飛薊素(1ug/ml)對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有影響，隨著濃度升高，K562細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度抑制，當(dāng)濃度大于50ug/ml后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制，抑制率分別為26.5％(50ug/ml)和71.2％(100ug/ml)，呈現(xiàn)濃度依賴性。 2.3水飛薊素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡經(jīng)100ug/ml水飛薊素處理48h，Hoechst染色后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)K

12、562細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮和“凋亡小體”；進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，用不同濃度水飛薊素(10，50，100ug/ml)處理48hr之后，AV染色陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多，證明水飛薊素有效誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡。接著我們用WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Caspase-3，Caspase-9和PARP的活化產(chǎn)物在水飛薊素處理后條帶明顯增強(qiáng)，且呈濃度依賴性。提示水飛薊素通過介導(dǎo)Caspase-9激活的線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡。 3酮康唑(KT

13、)對(duì)雄激素受體AR信號(hào)通路的下調(diào)作用3.1KT對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用前列腺癌細(xì)胞LNCaP，LNCaP-C81，LNCaP-Rec4，LNCaP-SF，Du145，PC3和22RV1經(jīng)過不同濃度KT作用48小時(shí)后，生長(zhǎng)受到不同程度抑制，均呈濃度依賴性。 3.2KT下調(diào)了前列腺癌細(xì)胞的AR蛋白表達(dá)以及PSA表達(dá)，分泌和轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)0，5，10，25ug/ml的KT作用24h和48h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KT能不同程度抑制細(xì)胞PSA表達(dá)，且

14、呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。對(duì)培養(yǎng)基上清進(jìn)行PSA測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞PSA的分泌隨著KT濃度的增加而逐漸減少，呈現(xiàn)濃度依賴性。用RealtimePCR測(cè)定KLK3(PSA的編碼基因)的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，KT能顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的KLK3基因表達(dá)，并且具有濃度梯度效應(yīng)，與PSA蛋白表達(dá)變化基本一致。PSA是AR的靶基因，由于其mRNA水平受到KT的影響而下調(diào)，我們進(jìn)一步觀察AR是否被KT影響。Westernblot結(jié)果顯示，經(jīng)KT處理后三種細(xì)胞的

15、AR表達(dá)水平不同程度的下降，而隨著KT濃度增高，AR表達(dá)不斷減少，說(shuō)明KT下調(diào)了AR信號(hào)通路。 3.3KT對(duì)細(xì)胞周期的影響用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，用KT10ug/ml處理22RV1細(xì)胞48hr之后，G0/G1期細(xì)胞增多，相應(yīng)的S期和G2/M期細(xì)胞都減少，提示在KT的作用下22RV1細(xì)胞發(fā)生了G0/G1細(xì)胞周期阻滯。用Westernblot進(jìn)一步探討細(xì)胞周期蛋白的變化，細(xì)胞周期蛋白依賴激酶Cdk4，CyclinD1和D3蛋白受到

16、KT的抑制而表達(dá)減少，Cip1/p21和Kip1/p27蛋白水平在KT處理后上調(diào)，呈濃度梯度依賴。 3.4KT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡DNALadder實(shí)驗(yàn)顯示，25ug/mlKT處理后22RV1細(xì)胞可見明顯DNALadder梯度，提示KT誘導(dǎo)22RV1細(xì)胞發(fā)生凋亡。WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在KT處理后Caspase-9，Caspase-3的切割活化片段條帶明顯增強(qiáng)，PARP也受到活化。 研究結(jié)論： 1.微囊藻毒素導(dǎo)致