腎母細胞瘤細胞株、腎母細胞瘤患兒血清蛋白質(zhì)檢測研究.pdf

1、研究背景:腎母細胞瘤(nephroblastoma)又名。腎胚胎瘤、wiims瘤(WT),是兒童最常見的腹膜后實體腫瘤之一。自90年代以來,腫瘤手術(shù)切除率近于100.0％,5年生存率達到80.0％。由于腎母細胞瘤為先天性疾病,發(fā)病年齡較低,兒童又有其自身特點無法及時準確感知病情,目前尚無行之有效的早期檢測手段。臨床實踐證明,如果能夠及早發(fā)現(xiàn),及時治療,部分術(shù)后的腎母細胞瘤患兒可達到臨床治愈、長期存活的療效。目前腎母細胞瘤主要依靠臨床癥狀

2、和超聲檢查、CT、泌尿系平片、靜脈腎盂造影等影像學手段,但這些檢查手段只有當腫瘤長到一定大小時才能被發(fā)現(xiàn),敏感性差。此外,當前尚未發(fā)現(xiàn)腎母細胞瘤診斷特異性強的生物學標記物。因此,探索一種簡單、快速、敏感性高和特異性強的新方法具有重要的臨床意義。
　　腎母細胞瘤的發(fā)生是多基因多階段多因素的動力學過程,是癌基因激活和抑癌基因失活的結(jié)果,涉及到多個基因,基因突變或調(diào)控異常時,細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在成份和數(shù)量上都會有相應的改變,通過對蛋白質(zhì)的動

3、態(tài)觀察可以了解腫瘤是否復發(fā)或轉(zhuǎn)移的動態(tài)變化。蛋白質(zhì)組學的發(fā)展為腫瘤預后監(jiān)測提供了新的方法和技術(shù)平臺。體外培養(yǎng)的細胞株雖然不能完全反映體內(nèi)細胞的生長狀態(tài)和生物學活性,但它具有成分單一,均質(zhì)性好,實驗條件容易控制等優(yōu)點。尤其在做對比性研究時可避免由組織細胞成分復雜,細胞異質(zhì)性高等缺點造成的結(jié)果不真實和不可靠。蛋白質(zhì)組學的表面增強激光解吸電離—飛行時間質(zhì)譜(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionizayio

4、n Time of Flight-Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)技術(shù)是近年開發(fā)的新型蛋白質(zhì)組學技術(shù),它應用基因芯片的設(shè)計原理,把層析、質(zhì)譜等技術(shù)合理地與蛋白質(zhì)芯片結(jié)合,可檢測出傳統(tǒng)方法難以鑒定的蛋白質(zhì)和多肽,是發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)標記物的理想方法,具有快速、靈敏、高通量等特點。目前已經(jīng)運用SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選出了腎母細胞瘤患兒的特異性血清蛋白標記物,并建立了早期診斷、腫瘤分期、術(shù)后及預后監(jiān)測的診斷模型,

5、本研究應用SELDI-TOF-MS技術(shù)分析腎母細胞瘤細胞株、正常胚腎細胞株和腎母細胞瘤患兒術(shù)前、術(shù)后血清中的差異蛋白,檢測出差異的蛋白質(zhì)表達,進一步探討用于腎母細胞瘤早期診斷的特異性蛋白質(zhì)標記物,以建立高特異性和敏感性的腎母細胞瘤診斷模型,同時評價該模型對腎母細胞瘤診斷的應用價值。研究目的檢測腎母細胞瘤細胞特異的蛋白質(zhì)標記物,構(gòu)建用于腎母細胞瘤早期診斷及鑒別診斷的蛋白質(zhì)圖譜模型。
　　材料與方法:1.材料:腎母細胞瘤細胞株(G40

6、1)和正常胚腎細胞株(CCC-HEK-1)均購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞中心。腎母細胞瘤患者血清標本100例(術(shù)前30例、術(shù)后70例),均來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院小兒外科,所有腎母細胞瘤均經(jīng)免疫組化和2名以上病理學教授證實。2.主要試劑和儀器：胎牛血清購自杭州四季清生物有限公司。F12培養(yǎng)液購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞中心。胰蛋白酶購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司。標準分子量蛋白m

7、arker購自MBI公司?？捡R斯亮蘭G-250(Coomassie brilliant blueG-250)購自美國Ameresco公司。BP121S型分析天平購自德國Sartorious公司。Hera CO2培養(yǎng)箱購自德國GMBH公司。倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。超聲細胞粉碎機購自寧波新芝生物股份有限公司。紫外分光光度計Thermo Helios購自美國熱電公司。乙酸鈉、尿素、NaAC、SPA(Sinapinic acid)、H

8、PLC水、CHAPS均購自美國Promega公司。表面增強激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight-Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)PBSⅡ(主要參數(shù):收集范圍為1000Da-50000Da;優(yōu)化范圍為2000Da-20000Da。)和弱陽離子蛋白質(zhì)交換芯片(WCX2)購自美國Ciphergen Bio

9、systems公司。蛋白質(zhì)芯片WCX2表面結(jié)合有弱型陰離子羧基,可以被分析物表面的正電荷基團相互作用(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸等)而捕獲蛋白,可用于檢測高等電點的蛋白質(zhì)和生物標記分子。應用軟件:Proteinchip Software3.2.0和Biomarker Wizard軟件。3.方法:1.患者血清的收集所有腎母細胞瘤患兒術(shù)前、術(shù)后外周靜脈全血標本均于清晨空腹抽取,4℃靜置1h后以3000rpm離心10min,分離出的血清儲存于-

10、86℃低溫冰箱中,術(shù)前編號為xq1-xq30,術(shù)后編號為xh1-xh70。2.細胞總蛋白質(zhì)的提取G401細胞采用含20％胎牛血清的F12培養(yǎng)液培養(yǎng),CCC-HEK-1細胞采用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),細胞鋪滿瓶底后,用胰蛋白酶使細胞與培養(yǎng)瓶分離提取細胞懸液;置入4℃,低溫離心機1000rpm,5min,棄去上清液,加入PBS液,吹打均勻,反復離心、清洗3次后,加入裂解液200μl,吹打混勻,上超聲粉碎機充分裂解后,4℃,低溫

11、離心機12000rpm,20min,提取上清液,采用分光光度計測定上清的蛋白濃度,G401細胞裂解液用裂解液調(diào)至樣品濃度為2g/L,CCC-HEK-1細胞裂解液用裂解液調(diào)至樣品濃度為1g/L,分裝-86℃儲存。G401細胞收獲3次,CCC-HEK-1細胞收獲2次,以排除組間差別。3.WCX2蛋白質(zhì)芯片操作步驟將標本置冰浴中解凍,100mmol/L NaAC(PH=4)稀釋后,和Bioprocessor預處理過的WCX2蛋白質(zhì)芯片結(jié)合反應

12、60min,上述NaAC緩沖液清洗芯片,取出芯片風干后點50％飽和的SPA溶液,將芯片放入SELDI讀譜儀中檢測。4.數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析蛋白質(zhì)芯片采用PBSⅡ-C型讀取數(shù)據(jù),用已知分子量的蛋白質(zhì)芯片將SELDI-TOF-MS系統(tǒng)校正到分子量誤差小于0.1％。分析參數(shù):激光強度為170,靈敏度為6,每個樣本收集總點數(shù)140次。收集數(shù)據(jù)范圍1000Da-30000Da,優(yōu)化范圍2000Da-20000Da。每份樣品至少在芯片3個不同點進行檢

13、測,以排除不同芯片點之間的差異。5.統(tǒng)計學處理采用Proteinchip Software3.2.0版本的分析軟件自動采集數(shù)據(jù),質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)Biomarker Wizard過濾噪音,聚類分析處理后,對初步篩選出的質(zhì)荷比峰數(shù)據(jù)做Wilconxon秩和檢驗,檢驗標準取α=0.01。每個m/z峰對樣本區(qū)分的差異顯著性不同。按照P值的大小可以比較每個質(zhì)荷比峰在各樣本中中表達差異的顯著性程度。P值越小說明這個質(zhì)荷比峰對區(qū)分兩類樣本越有意義。兩個

14、蛋白峰比較時,差異蛋白定義為蛋白峰強度相差一倍以上。相似蛋白為:如患者血清和體外培養(yǎng)蛋白質(zhì)對比,質(zhì)荷比相同即可;如體外培養(yǎng)蛋白質(zhì)之間對比,不僅質(zhì)荷比相同,且蛋白峰的強度相差一倍以下。采用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析,兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗,多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析及q檢驗,取α=0.05為檢驗標準,即P<0.05有統(tǒng)計學意義。以質(zhì)量控制蛋白質(zhì)芯片做重復性檢測,其峰值的大小及其相對強度的變異系數(shù)(cv)均控制在0.05

15、％和15％以下,具有良好的重復性。
　　結(jié)果：1.利用WCX2芯片分析腎母細胞瘤細胞裂解液與正常胚腎細胞裂解液之間存在的蛋白質(zhì)表達差異采用PBSⅡ-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機自動收集數(shù)據(jù),設(shè)有意義峰的信噪比(signal/noise)大于5,試驗結(jié)果表明,WCX2芯片發(fā)現(xiàn)G401、CCC-HEK-1細胞差異峰共19個,其中4287Da、4839Da、4984Da、5016Da、5322Da、5427Da、5930Da、8569Da、10

16、095Da、10411Da、10844Da、12765Da蛋白質(zhì)分子在腎母細胞瘤細胞G401中高表達,3020Da、3150Da、4083Da、4435Da、4705Da、5491Da、6881Da蛋白質(zhì)分子在正常胚腎細胞CCC-HEK-1中高表達。2.利用WCX2芯片分析腎母細胞瘤細胞(G401)裂解液與小兒腎母細胞瘤患兒術(shù)前血清之間存在的蛋白質(zhì)表達差異采用PBSⅡ-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機自動收集數(shù)據(jù),設(shè)有意義峰的信噪比(signal/

17、noise)大于5,試驗結(jié)果表明,WCX2芯片發(fā)現(xiàn)G401與小兒腎母細胞瘤術(shù)前血清中存在五處相似蛋白質(zhì),分別為4633Da、5051Da、6143Da、8569Da、9295Dao。3.利用WCX2芯片分析腎母細胞瘤細胞(G401)裂解液與小兒腎母細胞瘤患兒術(shù)后血清之間存在的蛋白質(zhì)表達差異采用PBSⅡ-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機自動收集數(shù)據(jù),設(shè)有意義峰的信噪比(signal/noise)大于5,試驗結(jié)果表明,WCX2芯片發(fā)現(xiàn)G401與小兒腎母

18、細胞瘤術(shù)后血清中存在十三處相似蛋白質(zhì),分別為4100Da、4290Da、4298Da、4394Da、4504Da、4548Da、4634Da、4800Da、5267Da、5495Da、5763Da、g570Da、9296Da。
　　結(jié)論：表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合細胞生物學檢測腎母細胞瘤細胞株、腎母細胞瘤患兒血清的差異蛋白質(zhì)表達,進一步探討用于腎母細胞瘤早期診斷的特異性蛋白質(zhì)標記物,以建立高特異性和敏感性的腎母細胞瘤