蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在小兒腎母細(xì)胞瘤臨床中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景:
　　 腎母細(xì)胞瘤(Nephroblastoma)是嬰幼兒最常見的腹部腫瘤,亦稱腎胚胎瘤或Wilms瘤,美國國家腎母細(xì)胞瘤研究組(NWTS)調(diào)查顯示:手術(shù)切除加術(shù)后規(guī)范化療,腎母細(xì)胞瘤Ⅰ期患兒8年存活率為90.5％～98.9％,Ⅱ～Ⅲ期為73.4％～88.7％,Ⅳ期僅為45.0％～57.1％。早期篩選及診斷并及時(shí)治療對(duì)其預(yù)后有顯著意義。但目前所使用的臨床檢查手段,尚不能滿足對(duì)腎母細(xì)胞瘤早期篩選及診斷的要求。NWTS在其

2、2001年的總結(jié)中提到:應(yīng)用CT診斷直徑小于3cm的腎母細(xì)胞瘤,仍有7％的漏診率。因此,探索和建立一種簡單、快速、敏感性高和特異性強(qiáng)的早期診斷技術(shù)已經(jīng)成了臨床醫(yī)學(xué)上的迫切需要。
　　 任何疾病在出現(xiàn)病理變化之前,細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在成分和數(shù)量上都會(huì)有相應(yīng)的改變,因此在理論上,通過對(duì)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀察可以篩選出疾病早期的指標(biāo)和征兆。當(dāng)然實(shí)現(xiàn)這種診斷的前提是要找到各種疾病的特殊標(biāo)志的分子,這種篩選是高通量的,用以前的常規(guī)方法很難做到。研究

3、顯示,腎母細(xì)胞瘤與一些基因的表達(dá)有關(guān),比如WT1(11p13),WT2(11p15),在16p,1p and17p發(fā)生基因突變。但是,由于WT1僅在15％的腎母細(xì)胞瘤患兒體內(nèi)發(fā)現(xiàn),而且目前其機(jī)理尚不清楚,這些基因不能被作為腎母細(xì)胞瘤早期診斷和判斷預(yù)后的特異性標(biāo)記物。蛋白質(zhì)組學(xué)以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式為研究對(duì)象,開辟了生命科學(xué)研究進(jìn)入后基因組時(shí)代的新天地,也為臨床醫(yī)學(xué)研究提供了全新的技術(shù)手段和思維模式。
　　 目前,對(duì)

4、惡性腫瘤蛋白質(zhì)標(biāo)記物的檢測已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。美國Ciphergen公司研制的表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜SELDI-TOF-MS(Surface Enhanced Laser Desorption/ Ionization Time of Flight-MassSpectrometry)技術(shù),可以非特異性地結(jié)合被測樣本中的各種蛋白質(zhì),當(dāng)在質(zhì)譜儀中受激光轟擊時(shí),各種結(jié)合的蛋白質(zhì)會(huì)被激發(fā)而形成氣化離子,由于不同質(zhì)荷比的離子在電場中飛

5、行的時(shí)間長短不一,因此接收裝置可根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)荷比的不同及量的多寡,直觀的用位置、強(qiáng)弱不同的峰表現(xiàn)出來,進(jìn)而形成圖譜用于分析。SELDI蛋白指紋技術(shù)在吸收傳統(tǒng)質(zhì)譜技術(shù)的基礎(chǔ)上,克服了常規(guī)蛋白檢測技術(shù)的缺點(diǎn),增加了特異性蛋白芯片閱讀系統(tǒng)和生物信息學(xué)分析軟件,事實(shí)證明,血清、尿液等體液中含有許多疾病早期診斷的標(biāo)志物,這是因?yàn)榧膊≡缙诰涂稍诘鞍踪|(zhì)水平出現(xiàn)未知的細(xì)微但重要的組合改變,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)使這種在復(fù)雜的背景中捕捉微小差異的研究成為可能。而

6、且整個(gè)測定過程可以在幾十分鐘內(nèi)完成,具有樣品用量小、操作簡便、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn),目前已成功將其應(yīng)用于卵巢癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、肝癌等惡性腫瘤的診斷、腫瘤標(biāo)志物的篩選及其他蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。
　　 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合支持向量機(jī)(SVM)的方法,對(duì)各期未經(jīng)治療腎母細(xì)胞瘤患兒、手術(shù)治療后的腎母細(xì)胞瘤患兒和健康兒童血清血清蛋白質(zhì)組進(jìn)行檢測,篩選出特異的蛋白質(zhì)標(biāo)記物,建立用于腎母細(xì)胞瘤早期診斷

7、、臨床分期及預(yù)后監(jiān)測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。在此基礎(chǔ)上,確定待鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)；將待鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)經(jīng)多維液相色譜分離純化(HPLC)、酶解、運(yùn)用串連液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜(LTQ)掃描后進(jìn)行分析獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF).通過SEQUEST軟件在BIOWORK蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索,并運(yùn)用生物信息學(xué)鑒定蛋白質(zhì),分析蛋白的生物學(xué)意義和生物學(xué)功能,作為腎母細(xì)胞瘤標(biāo)志物的候選蛋白。
　　 研究目的:
　　 檢測腎母細(xì)胞瘤患兒的血清蛋白質(zhì),

8、篩選其特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物,構(gòu)建用于腎母細(xì)胞瘤早期診斷、臨床分期及預(yù)后監(jiān)測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。并對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定。
　　 材料與方法:
　　 1.材料:血清標(biāo)本130例自2006年6月至2008年12月,在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科獲得。其中,腎母細(xì)胞瘤術(shù)前標(biāo)本30例(Ⅰ期6例,Ⅱ期10例,Ⅲ期10例,Ⅳ期4例)、術(shù)后2周24例(行根治術(shù)21例,行姑息切除術(shù)3例)、術(shù)后3月和6月各23例。30例術(shù)前腎母細(xì)胞瘤標(biāo)本

9、均經(jīng)2位以上病理學(xué)醫(yī)師證實(shí)。其中男21例,女9例。年齡24d～10歲,平均2.8±1.6歲。門診體檢的健康兒童30例做為正常對(duì)照組。與患兒年齡、性別相匹配,男21例,女9例,平均年齡2.6±0.1歲。外周靜脈血標(biāo)本均于清晨空腹時(shí)抽取,靜置1小時(shí)后3000rpm離心10min,收集血清樣本,將樣本進(jìn)行編號(hào),標(biāo)記后分裝儲(chǔ)存于-80℃保存。
　　 2.主要試劑和儀器:來自中國科學(xué)研究院生物物理研究所:三氟乙酸(TFA瑞士Fluka公司

10、)、乙腈(ACN美國Fisher Scientific公司)、細(xì)胞色素C(分子量12361.96)、胰島素(分子量5734.51)、a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、胰蛋白酶(美國Promega)、碘乙酰胺(IAM德國 AppliChem公司)、二硫蘇糖醇(DTF德國BIO-RAD)、Ziptip C18吸管尖(美國Millipore公司)、SPD SpeedVac真空離心濃縮系統(tǒng)(美國 Thermo Electron公司)、液相色

11、譜儀LC-10Avp(日本-島津 SHIMADZU公司)、新型基質(zhì)輔助激光電離飛行時(shí)間質(zhì)量分析系統(tǒng)(MALDI-TOF MS)AXIMA-CFRTM plus(英國 Kratos Analytical公司)、LTQ線性離子阱液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(美國Thermo Finnigan公司)。
　　 3.質(zhì)譜分析前樣本的制備過程
　　 (1)確立目標(biāo)蛋白質(zhì)
　　 SELDI蛋白芯片操作路線:冰浴中解凍血清標(biāo)本,4℃10000

12、rpm(離心半徑0.5 m)離心2 min。取96孔板置冰盒上,每孔加U9(9 mol/L尿素,2％CHAPS,1％DTT)10μl,血清5μl,4℃層析柜600 rpm振蕩30 min。在震蕩結(jié)束前15 min做芯片預(yù)處理,芯片裝 Bioprocessor中,記下芯片號(hào),每孔加NaAC(100mmol/L,pH4)200μl,層析柜中600 rpm振蕩2 min,重復(fù)以上操作1次。U9處理后的96孔板置冰上,排槍加NaAC185μl,

13、層析柜4℃600 rpm震蕩2 min。取已處理的樣本100μl加到芯片上,置層析柜4℃600 rpm結(jié)合1h,甩去殘液,快速拍干。加NaAC200μl,600 rpm振蕩5 min后,甩掉,拍干,重復(fù)3次。200μl去離子水沖洗各孔2次,快速甩干。每孔分兩次加入50％飽和的SPA1μl,干燥后上機(jī)待測。
　　 數(shù)據(jù)收集與處理:用已知分子量的蛋白芯片將SELDI-TOF-MS系統(tǒng)校正到分子量誤差小于0.1％。將結(jié)合好蛋白質(zhì)的WC

14、X2蛋白芯片用質(zhì)譜閱讀儀分析。以質(zhì)控血清作重復(fù)性檢測。所有數(shù)據(jù)用Proteinchip Software3.1做校正,使總離子的強(qiáng)度及分子量均一化。ZUCI-ProteinChip Data Analyze System軟件包分析。質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾噪音,聚類分析處理后,對(duì)初步篩選出的質(zhì)荷比峰數(shù)據(jù)做Wilconxon秩和檢驗(yàn),檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取a=0.01。使用線性的支持向量機(jī)(SVM)分類器,具體設(shè)置:采用徑向基核函數(shù),Gamma值設(shè)為0.6

15、,罰分函數(shù)(c)設(shè)為19。特征向量的選取采用統(tǒng)計(jì)過濾結(jié)合模型依賴性篩選的方法,建立判別模型,用留一法交叉驗(yàn)證評(píng)估模型的判別效果。
　　 (2)純化目標(biāo)蛋白質(zhì)
　　 于-80℃冰箱中取出血清樣本,冰水浴中解凍。解凍后,取血清100μl,加入350μl超純水,再加入700μl純ACN。將上述混合液置入-20℃冰箱中,30 min后取出,離心10 min(13000 rpm)。取離心后的上清液移入新試管,置入SPDSpeedV

16、ac中凍干約20 min。將凍干后的樣品上樣至高效液相色譜儀(HPLC)中。收集不同時(shí)間的純化液。將純化出的蛋白液置入SPD SpeedVac中凍干,凍干至約20μl。將上述樣品與CHCA各取1.5μl,兩者混合后點(diǎn)樣至MALDI靶板上,待干。同時(shí)用Cytochrome C+CHCA和Insulin+CHCA校樣。將靶板置入MALDI-TOF-MS中檢測,找出SELDI-TOF-MS所篩質(zhì)荷峰值的特異樣本。
　　 (3)蛋白質(zhì)酶

17、解
　　 將蛋白液加超純水至容積為40μl,再加入配好的濃度為0.1 mol的DTT溶液(11 mol的DTT溶液5μl+45μl的超純水)4μl后,置于37℃溫水中水浴1h。向44μl的溶液中加入1.6μl的IAM后避光放置1h。向45.6μl的溶液中依次加入1.6μ的1mol的DTT溶液,15μl的0.1 mol的NH4HC03(碳酸氫氨)溶液和2μl的胰蛋白酶,然后置于37℃溫水中過夜(6-8 h)。
　　 4.蛋

18、白質(zhì)鑒定
　　 取經(jīng)酶解后蛋白液填柱上樣。將樣品全部上到毛細(xì)色譜柱上,經(jīng)過液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜掃描后得到得肽質(zhì)量指紋圖譜,經(jīng)過SEQUST檢索程序在Bioworks數(shù)據(jù)庫查詢。運(yùn)用生物信息學(xué)鑒定蛋白質(zhì),分析蛋白的生物學(xué)意義和生物學(xué)功能,作為腎母細(xì)胞瘤標(biāo)志物的候選蛋白。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(x)±s表示,根據(jù)數(shù)據(jù)類型采用不同的檢驗(yàn)方法?；純盒g(shù)前與正常對(duì)照組；腎母細(xì)胞瘤患兒各期:手術(shù)的后、術(shù)后與正常對(duì)照組

19、的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析使用t檢驗(yàn),各分期的質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用單因素方差分析,方差不齊使用秩和檢驗(yàn),以P<0.05做為差異有顯著性的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。全部統(tǒng)計(jì)計(jì)算均在SPSS13.0軟件處理包下完成。
　　 結(jié)果：
　　 1.應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)腎母細(xì)胞瘤患兒血清蛋白標(biāo)記物篩查
　　 1.1腎母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)指紋圖譜實(shí)驗(yàn)方法的建立及蛋白質(zhì)芯片種類的篩選:本研究對(duì)血清樣本處理時(shí)使用了0.5％CHAPS,應(yīng)用Cibacron

20、 Blue3GA特異性地除去血清中的白蛋白,通過對(duì)4種不同的蛋白芯片WCX2蛋白芯片、SAX2蛋白芯片、IMAC3蛋白芯片及H4蛋白芯片研究發(fā)現(xiàn),不同芯片所能結(jié)合的血清蛋白質(zhì)的數(shù)量不同,H4芯片在本研究中證實(shí)能得到更多有意義的峰值,可更好地應(yīng)用于腎母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的研究,而且具有很好的重復(fù)性。
　　 1.2本研究首次報(bào)道運(yùn)用SELDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合SVM建立腎母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。60例血清標(biāo)本的蛋白

21、質(zhì)指紋圖譜經(jīng)質(zhì)譜儀收集數(shù)據(jù),隨機(jī)分為訓(xùn)練組和測試組。在收集每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)前用己知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白芯片校正,誤差小于0.1％。以質(zhì)控血清作重復(fù)性檢測,其峰值大小及其強(qiáng)度的變異系數(shù)(CVs)均控制在誤差范圍內(nèi)(0.05％和15％以下),應(yīng)用ProteinChip Software3.1(Ciphergen Inc)軟件同時(shí)將所有樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)M/Z在2000到30000的峰值進(jìn)行兩次信噪比過濾,找出樣本質(zhì)荷峰,以10％為最小閾值對(duì)質(zhì)荷峰進(jìn)行聚

22、類。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析,根據(jù)P值評(píng)價(jià)各個(gè)峰對(duì)區(qū)分兩類樣本的相對(duì)重要性。將差異顯著的質(zhì)荷峰隨機(jī)組合輸入SVM,篩選標(biāo)志物,建立判別模型。用留一法交叉驗(yàn)證評(píng)估模型,進(jìn)行盲法測試。按排列順序依次增加M/Z峰,本研究發(fā)現(xiàn),測試集的youden指數(shù)在M/Z的組合為5的時(shí)侯最佳,效果可達(dá)98.6％的準(zhǔn)確率。這5個(gè)M/Z峰分別為6455,6984,3221,5639,9190。用30例樣本做訓(xùn)練,30例樣本做為盲法測試樣本。建立模型的特

23、異度為98.3％(95％的可信區(qū)間85％～100％),敏感度為98.9％(95％的可信區(qū)間為89％～100％),Youden指數(shù)值為0.87551,表明該模型在鑒別腎母細(xì)胞瘤中有很好的診斷價(jià)值。1.3 M/Z峰分別為6455、6984、3221、5639、9190的質(zhì)譜圖顯示,它們?cè)谀I母細(xì)胞瘤中低表達(dá),在健康兒童中高表達(dá)。其中,M/Z位于6455,9190的峰值在健康兒童、腎母細(xì)胞瘤患兒中表達(dá)依次降低,設(shè)想M/Z6455,M/Z9190

24、的蛋白質(zhì)可能在腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　 2.血清蛋白標(biāo)記物在腎母細(xì)胞瘤患兒臨床分期及預(yù)后中的應(yīng)用
　　 2.1經(jīng)過初步篩選,得到腎母細(xì)胞瘤Ⅰ期組和腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期組質(zhì)譜483個(gè)M/Z峰,篩選出3個(gè)M/Z峰5022.4、7965.4和8469.6,它們?cè)谀I母細(xì)胞瘤Ⅰ期組中高表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期組中低表達(dá)。在測試集上判別模型的敏感性為80.00％,特異性為100.00％。腎母細(xì)胞瘤Ⅰ期組和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組質(zhì)譜

25、496個(gè)M/Z峰,篩選出4個(gè)M/Z峰4330.7、4303.7、4263.2和4122.8,它們?cè)谀I母細(xì)胞瘤Ⅰ期組中高表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組中低表達(dá)。在測試集上判別模型的敏感性為100.00％,特異性為100.00％。腎母細(xì)胞瘤Ⅰ期組和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組質(zhì)譜565個(gè)M/Z峰,篩選出2個(gè)M/Z峰8179.1和10836.6,它們?cè)谀I母細(xì)胞瘤Ⅰ期組中高表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組中低表達(dá)。在測試集上判別模型的敏感性為88.89％,特異性為100

26、.00％。腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期組和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組質(zhì)譜490個(gè)M/Z峰,篩選出2個(gè)M/Z峰4143.2和5019.2,它們?cè)谀I母細(xì)胞瘤Ⅱ期組中高表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組中低表達(dá)。在測試集上判別模型的敏感性為88.89％,特異性為100.00％。腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期組和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組質(zhì)譜508個(gè)M/Z峰,篩選出M/z峰為7976.5在腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期組中高表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組中低表達(dá)。在測試集上判別模型的敏感性為100.00％,特異性為100.0

27、0％。腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組質(zhì)譜504個(gè)M/Z峰,篩選出M/Z峰為8194.4在腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組中高表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組中低表達(dá)。在測試集上判別模型的敏感性為93.75％,特異性為100.00％。腎母細(xì)胞瘤Ⅰ+Ⅱ期組和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ+Ⅳ期組質(zhì)譜519個(gè)M/Z峰,篩選出2個(gè)M/Z峰3257.6和4153.9,它們?cè)谀I母細(xì)胞瘤Ⅰ+Ⅱ期組中高表達(dá),在腎母細(xì)胞瘤Ⅲ+Ⅳ期組中低表達(dá)。在測試集上判別模型的敏感性為83.33％,特異性為

28、93.75％。
　　 2.2隨著患兒臨床分期的增高,M/Z位于6455,9190的峰值在腎母細(xì)胞瘤患兒血清中表達(dá)依次降低。
　　 2.3腎母細(xì)胞瘤患兒SEIDI分期:Ⅰ期6例,Ⅱ期10例,Ⅲ期10例,Ⅳ期4例,30例腎母細(xì)胞瘤分期均與病理結(jié)果相一致,各期符合率為100.00％。通過病理及手術(shù)證實(shí),CT各期符合率依次為100.00％,85.00％,85.00％,75.00％。
　　 2.4腎母細(xì)胞瘤手術(shù)前、后組比較

29、篩選到差異最顯著的m/z位于6455.5、9190.8處的蛋白質(zhì)標(biāo)志物,在術(shù)前組血清中低表達(dá),術(shù)后組及健康兒童組中呈高表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；術(shù)后組和正常小兒組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。表明瘤體切除后,這種抑制作用被削弱,蛋白質(zhì)表達(dá)升高。
　　 2.5對(duì)腎母細(xì)胞瘤患兒手術(shù)后血清蛋白質(zhì)譜及健康兒童組比較,發(fā)現(xiàn)將21例根治術(shù)后與術(shù)前患兒標(biāo)本比較,M/Z峰值位于6455.5表達(dá)在術(shù)后2周、3個(gè)月和6個(gè)月,根治

30、術(shù)組分別為2087.21±658.33、2189.67±856.42和2232.16±598.32(與對(duì)照組比較:P>0.05；與術(shù)前組比較:P<0.01),姑息術(shù)組分別為1044.86±533.21、677.86±435.26和431.65±158.31(與對(duì)照組比較:P<0.01;與術(shù)前組比較:P>0.05)；M/Z峰值位于9190.8表達(dá)在術(shù)后2周、3個(gè)月和6個(gè)月,根治術(shù)組分別為1101.20±219.69、1078.21±322

31、.43和1066.06±110.45(與對(duì)照組比較:P>0.05；與術(shù)前組比較:P<0.01),姑息術(shù)組分別為328.11±210.26、289.10±108.09和276.49±92.15(與對(duì)照組比較:P<0.01；與術(shù)前組比較:P>0.05)。姑息術(shù)組在術(shù)后2周、3月、6月血清中2個(gè)蛋白標(biāo)記物呈持續(xù)低表達(dá)；根治術(shù)患兒術(shù)后3月、6月跟蹤復(fù)查發(fā)現(xiàn)血清蛋白質(zhì)在此兩個(gè)峰值表達(dá)無明顯改變。分期愈低,預(yù)后愈好,M/Z強(qiáng)度愈高。考慮3例姑息性切

32、除術(shù)由于仍有瘤體存在,被抑制的蛋白質(zhì)持續(xù)受到抑制,蛋白質(zhì)標(biāo)記物呈持續(xù)低表達(dá),除1例術(shù)后2月死亡外,2例術(shù)后3及6個(gè)月表達(dá)繼續(xù)下降,可能是該蛋白質(zhì)標(biāo)記物被抑制加深的結(jié)果。
　　 3.腎母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的鑒定
　　 在本實(shí)驗(yàn)中,我們將質(zhì)荷峰為6455.5、9190.8的血清樣本確立為目標(biāo)蛋白質(zhì),通過鑒定二者的氨基酸序列,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索,與這2種差異蛋白質(zhì)分子量相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)分別為:載脂蛋白C-I和觸珠蛋白。我們推測