iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)在結(jié)直腸癌患者血清中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的:
　　 結(jié)直腸癌在世界范圍內(nèi)死亡率排名第三，而結(jié)直腸癌患者的生存率與患者發(fā)現(xiàn)時(shí)的腫瘤分期密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)越早生存率越高。結(jié)腸鏡大大提高了結(jié)直腸癌的診斷率，但是它有創(chuàng)、昂貴及不方便操作等特點(diǎn)限制了它的應(yīng)用。而血清腫瘤標(biāo)志物以其無創(chuàng)經(jīng)濟(jì)快速等特點(diǎn)成為了全世界相關(guān)研究人員關(guān)注的對(duì)象。目前結(jié)直腸癌的腫瘤標(biāo)志中最為可靠并廣泛應(yīng)用的只有CEA，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需求，本研旨在用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找能夠作為早期診斷或預(yù)后判斷的新的腫瘤標(biāo)

2、志物。對(duì)候選腫瘤標(biāo)志物ORM2分析其在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，探討其在結(jié)直腸癌組織分級(jí)和臨床分期中的表達(dá)差異;檢測(cè)ORM2在結(jié)直腸癌及良性腸道疾病患者血清中的含量，探討血清ORM2水平在良惡性腸道疾病鑒別診斷中的價(jià)值。
　　 方法:
　　 1)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法ITRAQ分析。收集結(jié)直腸癌病人血清10例與正常對(duì)照組血清10例，提蛋白后去除12種高峰度蛋白，然后用trypsin進(jìn)行蛋白消化得到肽段。用iTRAQ試劑標(biāo)記消化

3、后的肽段，114標(biāo)記癌癥病人組，117標(biāo)記正常對(duì)照組。將標(biāo)記的肽段混合后運(yùn)用強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱(strongcationexchange，SCX)和C18柱進(jìn)行分離，最后運(yùn)用MALDI-TOF/TOF和micro-QTOF質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，得到差異蛋白。
　　 2)通過MetaCore生物網(wǎng)絡(luò)分析，分析差異蛋白，預(yù)測(cè)差異蛋白的在生物網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)系。
　　 3)采用westernblot法確認(rèn)ORM2蛋白在41例結(jié)直腸癌組織及41例

4、癌旁正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)，說明ORM2的表達(dá)在癌組織與正常組織間的不同。
　　 4)應(yīng)用RT-PCR的方法對(duì)結(jié)直腸癌患者術(shù)后病理組織標(biāo)本及相應(yīng)的結(jié)直腸癌瘤旁正常腸組織進(jìn)行mRNA水平的驗(yàn)證。
　　 5)采用ELISA雙抗夾心法和化學(xué)發(fā)光法分別檢測(cè)了180例結(jié)直腸癌、59例結(jié)直腸息肉、53例炎性腸道疾病、62例腺瘤和65例正常健康組的血清OPM2和CEA水平，并計(jì)算其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6)應(yīng)用受試者工作特征曲線

5、(Receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC)分別評(píng)價(jià)ORM2和CEA在鑒別診斷良惡性腸道疾病中的敏感性及特異性。
　　 結(jié)果:
　　 1)用ITRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定差異蛋白，最終共發(fā)現(xiàn)76個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中兩個(gè)或兩個(gè)以上肽段進(jìn)行定量鑒定的蛋白有61個(gè)，采用單個(gè)肽段進(jìn)行定量鑒定的蛋白有15個(gè)。分別用DATAANALYSIS4.0軟件與WARP-LC軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，MASCO

6、T搜索質(zhì)譜匹配蛋白，在鑒定出的76個(gè)蛋白點(diǎn)中，以正常組為對(duì)照，其中有13個(gè)差異表達(dá)蛋白具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中9個(gè)表達(dá)上調(diào)，4個(gè)表達(dá)下調(diào)，這13個(gè)差異蛋白的功能涉及到補(bǔ)體系統(tǒng)、糖蛋白等。
　　 2)將得到的13種差異蛋白上傳MetaCore進(jìn)行在線分析。得到ORM、補(bǔ)體系統(tǒng)等相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，在網(wǎng)絡(luò)圖中每一個(gè)蛋白占據(jù)一個(gè)節(jié)點(diǎn)，利用節(jié)點(diǎn)蛋白表達(dá)的上調(diào)下調(diào)信息，還可以推斷可能變化的蛋白質(zhì)。
　　 3)WesternBlot結(jié)果顯

7、示癌組織中ORM2蛋白表達(dá)為正常組織的2.55倍(P＜0.01)，具有顯著性差異，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。(p＜0.01)。
　　 4)RT-PCR結(jié)果顯示癌組織中ORM2基因表達(dá)為正常組織的2.65倍(P＜0.01)。
　　 5)血清ORM2的濃度在結(jié)直腸癌組的濃度明顯高于正常對(duì)照組、結(jié)直腸息肉組和腺瘤組(P＜0.001)。血清ORM2濃度在腸道炎癥性疾病中的濃度明顯高于正常對(duì)照組、結(jié)直腸息肉組和腺瘤組(P＜0.001)

8、。腸道炎癥性疾病病人的血清ORM2濃度明顯高于結(jié)直腸癌癥組(p＜0.05);結(jié)直腸癌組血清ORM2濃度和年齡、性別、組織類型和TNM分期物明顯差異(p＞0.05)。血清CEA升高和正常組的CRC病人之間血清ORM2水平差異顯著(p＜0.05)
　　 6)ORM2的ROC曲線面積為0.676，Cutoff為176.9U/mL，此時(shí)，其診斷結(jié)直腸癌的敏感度67.8％，特異度為62.8％
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)首次

9、將定量蛋白質(zhì)組學(xué)ITRAQ技術(shù)應(yīng)用于結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物的研究當(dāng)中。ITRAQ技術(shù)在腫瘤標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)方面可以與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)呼應(yīng)，具有較高的重復(fù)性和經(jīng)確性，能夠發(fā)現(xiàn)一些候選的標(biāo)志物。
　　 對(duì)篩選出的候選腫瘤標(biāo)志物ORM2的驗(yàn)證得出，結(jié)直腸癌組織中ORM2在蛋白水平和mRNA水平表達(dá)均明顯升高，血清ORM2水平在結(jié)直腸癌患者中顯著升高，同時(shí)腸道炎癥性疾病血清ORM2明顯增高。這就說明血清ORM2在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中有一定的作用