結(jié)直腸癌組織差異表達蛋白質(zhì)的鑒定與分析.pdf

1、目的：蛋白質(zhì)組學可動態(tài)、整體、定量地觀察腫瘤發(fā)生、進展中蛋白質(zhì)種類、數(shù)量的改變，結(jié)合功能蛋白質(zhì)組的研究，依托大規(guī)模雙向電泳和質(zhì)譜分析的體系和生物信息學分析技術(shù)，有希望找到控制腫瘤進程關(guān)鍵作用的蛋白分子。本研究擬采用雙向電泳分離結(jié)直腸癌與正常組織的總蛋白質(zhì)，建立雙向電泳圖譜，尋找表達差異點，通過質(zhì)譜分析鑒定，尋找與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)。應用Realtime-PCR、Western blot和免疫組化等方法在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平對其表達

2、差異進行驗證，并分析其與結(jié)直腸癌組織學分級、臨床分期和預后等的關(guān)聯(lián)性。以期通過此研究，為進一步揭示結(jié)直腸癌發(fā)病機制，尋找有意義的腫瘤標記物及藥物治療的靶點，提供新的線索和思路。
　　 方法：⑴收集外科手術(shù)切除的12例結(jié)直腸腺癌和配對的12例正常結(jié)直腸粘膜新鮮組織標本，通過雙向電泳技術(shù)分離總蛋白，得到12組雙向電泳凝膠圖譜。采用Imaging Master2D分析軟件進行合成、比對和差異分析，尋找結(jié)直腸癌組織和正常組織之間的差異表

3、達蛋白斑點。選取差異蛋白質(zhì)點，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索進行差異蛋白質(zhì)鑒定。⑵應用Realtime PCR和Western blot方法從mRNA水平和蛋白水平對候選分子Prohibitin(PHB)和14-3-3ζ在結(jié)直腸腺癌和配對正常腸粘膜組織的表達差異進行驗證。⑶組織芯片結(jié)合免疫組化方法檢測PHB和14-3-3ζ在187例結(jié)直腸腺癌、150例正常腸粘膜組織和62例腺瘤石蠟標本

4、中的表達，應用統(tǒng)計學方法對這兩種蛋白在不同組織間的表達差異性和組織學分級、病理分期和預后等關(guān)聯(lián)性進行分析。
　　 結(jié)果：①12組結(jié)直腸癌與正常組織的雙向電泳圖譜分辨率高、重復性好，每塊凝膠檢測平均蛋白質(zhì)斑點數(shù)分別為985±45和1012±53。選擇表達差異2倍以上的40個點，經(jīng)質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索成功鑒定出35個蛋白，其中17個在癌組織中上調(diào)，18個下調(diào)。對鑒定出的差異蛋白進行了功能和細胞定位的分析和歸類，選擇確定結(jié)直腸癌

5、相關(guān)蛋白候選分子PHB和14-3-3ζ進行深入研究。②Western blot結(jié)果顯示，與正常結(jié)直腸粘膜組織相比，PHB蛋白和14-3-3ζ蛋白在結(jié)直腸癌癌組織中表達明顯增強(P＜0.01)，與蛋白質(zhì)組學結(jié)果一致。③免疫組化結(jié)果顯示PHB蛋白在結(jié)直腸癌癌組織中表達顯著高于正常組織和腺瘤組織(P＜0.01)；但PHB蛋白在正常粘膜組織和腺瘤中表達未見差異(P＞0.05)。14-3-3ζ蛋白在正常粘膜組織、腺瘤組織和癌組織的表達呈現(xiàn)逐漸升高

6、的趨勢(P＜0.001)。在癌組織中，PHB和14-3-3ζ蛋白表達與病理分級呈負相關(guān)(P＜0.01)；但與患者性別、年齡、腫瘤大小、發(fā)病部位、臨床分期及預后無關(guān)聯(lián)性(P＞0.05)。4.Realtime PCR結(jié)果顯示PHB mRNA和14-3-3ζmRNA在結(jié)直腸癌癌組織中與正常組織中無顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：⑴運用雙向電泳技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析及生物信息學分析方法篩選并鑒定出的35個差異蛋白質(zhì)可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生

7、、發(fā)展有關(guān)。⑵應用WesternBlot，組織芯片結(jié)合免疫組織化學技術(shù)驗證篩選差異表達蛋白，發(fā)現(xiàn)PHB在結(jié)直腸癌中表達顯著上調(diào)，而腺瘤與正常粘膜組織相比表達未見差異。從正常粘膜組織、腺瘤組織到癌組織，14-3-3ζ蛋白的表達呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。PHB、14-3-3ζ表達與結(jié)直腸癌癌組織的分化程度相關(guān)，隨著分化程度的降低其表達逐漸增強。⑶PHB和14-3-3ζ可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用，其機制與PHB和14-3-3ζ基因的轉(zhuǎn)錄