基于iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選結(jié)直腸癌相關(guān)糖蛋白.pdf

1、目的:本研究通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較遠(yuǎn)癌正常組織、不同腫瘤相關(guān)糖類抗原(Tn)表達(dá)的結(jié)直腸癌組織的差異表達(dá)糖蛋白，以期篩選到與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的糖蛋白，為進(jìn)一步研究與Tn抗原相關(guān)O型糖蛋白在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用打下基礎(chǔ)，并為結(jié)直腸癌的診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)和防治提供新的靶標(biāo)。
　　方法:收集2011年11月到2012年4月9例中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院病理確診結(jié)直腸癌患者術(shù)后新鮮結(jié)直腸癌組織和距癌旁5-10cm以外的正常結(jié)直腸腸粘膜

2、組織，根據(jù)Tn染色結(jié)果分為Tn陽(yáng)性結(jié)直腸癌組（Tn+組）、Tn陰性結(jié)直腸癌組（Tn-組）和正常結(jié)直腸粘膜組織組（正常組），按分組選取部分組織分別提取組織總蛋白，采用相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)聯(lián)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2D LC-MS/MS)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)各組總蛋白進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，所得差異蛋白及肽段信息經(jīng)ProteinPilot軟件進(jìn)行分析，運(yùn)用Uniprot、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白質(zhì)分類進(jìn)行分析，得出差異

3、表達(dá)的糖蛋白和O型糖蛋白;再根據(jù)String、 GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)糖蛋白相互關(guān)系及O型糖蛋白相互關(guān)系和功能聚類、代謝途徑分類進(jìn)行分析;根據(jù)初步分析結(jié)果，從差異表達(dá)O型糖蛋白中選取核心蛋白多糖(DCN)和含山梨醇和SH3結(jié)構(gòu)域蛋白1(SORBS1)分別進(jìn)行組織和細(xì)胞表達(dá)水平的蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1、iTRAQ標(biāo)記的2D LC-MS/MS結(jié)果:共有1051種非冗余差異蛋白被鑒定，其中有定量信息，且≥

4、2條匹配肽段在95％置信區(qū)間內(nèi)的蛋白質(zhì)有750種;Tn-組與正常組之間存在差異的蛋白有330種，Tn+組與正常組之間存在差異的蛋白有317種，Tn-組與Tn組+之間存在差異的蛋白有316種;Tn-組與Tn+組之間的差異蛋白質(zhì)中，糖蛋白共55種，O型糖蛋白19種，19種O型糖蛋白中，其中12種在Tn-、Tn+、正常組，兩兩之間均存在差異。
　　2、差異蛋白質(zhì)相互作用分析:55種糖蛋白中，K8和K18獨(dú)立1個(gè)相互作用網(wǎng)，35種蛋白形成

5、1個(gè)相互作用網(wǎng)，占所有蛋白質(zhì)的63.64％，余18種蛋白不在相互作用網(wǎng)內(nèi);而在19種O型糖蛋白中，K8和K18仍然是獨(dú)立的1個(gè)關(guān)系作用網(wǎng)，10種蛋白質(zhì)處于同一個(gè)關(guān)系作用網(wǎng)中，占所有蛋白質(zhì)的52.63％，余7種蛋白不屬于任何相互作用網(wǎng)。
　　3、差異O型糖蛋白GO功能聚類及KEGG代謝途徑分類:(1)生物進(jìn)程功能注釋分類，發(fā)現(xiàn)19種O型糖蛋白主要參與了代謝過程、調(diào)節(jié)生物過程、細(xì)胞代謝過程等10種生物進(jìn)程，其中參與代謝過程的差異蛋白1

6、2種，占63.12％，參與調(diào)節(jié)生物進(jìn)程的差異蛋白質(zhì)10種，占52.63％;(2)分子功能注釋分類，發(fā)現(xiàn)這些差異O型糖蛋白參與結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)、催化活性、酶調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)6種分子功能，其中參與結(jié)合功能的差異O型糖蛋白占68.42％;(3)細(xì)胞組成功能注釋分類，發(fā)現(xiàn)差異O型糖蛋白參與了細(xì)胞部分、細(xì)胞器、細(xì)胞器部分部分等8種細(xì)胞組成成分，其中參與細(xì)胞部分、細(xì)胞器部分、細(xì)胞器的蛋白質(zhì)分別占57.89％、73.68％、52.63

7、％;(4) KEGG代謝途徑分類，12種差異O型糖蛋白參與了25條代謝途徑，4條信號(hào)通路。其中Fibronectin和Heat shock protein HSP90-beta參與的代謝途徑最多，Decorin，SORBS1，Heat shock proteinHSP90-beta三種蛋白分別參與了四種信號(hào)通路。
　　4、根據(jù)初步相互關(guān)系和功能聚類分析結(jié)果，從以上O型糖蛋白中選擇Decorin、SORBS1兩種蛋白質(zhì)，分別在Tn-

8、、Tn+結(jié)直腸癌組織/細(xì)胞及正常結(jié)直腸粘膜組織中進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示以上2種蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化與其蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，即Tn-、Tn+結(jié)直腸癌組織中Decorin、SORBS1較正常結(jié)直腸粘膜組織表達(dá)均下調(diào)，同時(shí)Tn+結(jié)直腸癌細(xì)胞或組織較Tn-組表達(dá)水平明顯降低。
　　5.Decorin、SORBS1兩種蛋白的表達(dá)量，在不同腫瘤分化程度、分期、性別、年齡組間其表達(dá)量也存在差異，但是除在不同分化程度之間表達(dá)量差

9、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、本研究發(fā)現(xiàn)Tn-、Tn+結(jié)直腸癌組織之間及與遠(yuǎn)癌正常結(jié)直腸粘膜組織兩兩之間均存在明顯差異表達(dá)的O型糖蛋白譜;其中Keratin8、Keratin18、Decorin、sorbin and SH3 domin-cotaining protein1(SORBS1)、CD44antigen，與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展以及Tn抗原表達(dá)相關(guān)，為進(jìn)一步篩選結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)蛋白和

10、臨床診斷預(yù)警指標(biāo)，以及研究O型糖蛋白在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　2、差異表達(dá)O型糖蛋白的蛋白質(zhì)相互作用和功能聚類分析發(fā)現(xiàn)，19種O型糖蛋白中，12種蛋白質(zhì)處于2個(gè)不同關(guān)系作用網(wǎng)中，余7種蛋白不屬于任何相互作用網(wǎng);19種O型糖蛋白主要參與了代謝過程、調(diào)節(jié)生物過程、細(xì)胞代謝過程等不同生物進(jìn)程，表現(xiàn)出結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)、催化活性、酶調(diào)節(jié)活性、結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)、轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)等不同的分子功能;但與結(jié)直腸癌發(fā)生的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。