利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選與種公雞繁殖力相關(guān)的候選蛋白.pdf

1、中國(guó)地方雞種肉蛋品質(zhì)優(yōu)良，抗病能力強(qiáng)，但繁殖效率較低。進(jìn)一步調(diào)查發(fā)現(xiàn)，地方雞無(wú)精癥、弱精癥比例較高，而且精液量的減少常常伴隨著精子濃度降低，提高了地方雞生產(chǎn)中公母配比上升。增加了動(dòng)物生產(chǎn)成本。研究發(fā)現(xiàn):雞精液品質(zhì)性狀為中等遺傳力性狀，較大程度上受到遺傳因素的影響。本研究目的是探究影響繁殖力的遺傳因素。
　　蛋白質(zhì)作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，直接調(diào)控性狀。本研究通過(guò)篩選低繁殖力公雞與正常公雞，比較睪丸發(fā)育學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，檢測(cè)低繁殖力公雞與正

2、常公雞睪丸組織蛋白表達(dá)量的差異，利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）技術(shù)及生物信息學(xué)分析，篩選與繁殖力相關(guān)的候選蛋白，并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證，為進(jìn)一步深入研究影響公雞繁殖力及睪丸發(fā)育分子遺傳機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和潛在方向。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.低繁殖力公雞挑選及睪丸特征比較。試驗(yàn)動(dòng)物為42周齡相同環(huán)境下飼養(yǎng)北京油雞公雞200只，通過(guò)精液品質(zhì)檢測(cè)和交配試驗(yàn)挑選出差異顯著的低繁殖力與正常種公雞各25只。52周齡獲取睪丸組

3、織，稱重，制作組織切片并觀測(cè)睪丸精細(xì)小管形態(tài)，綜合比較低繁殖力公雞與正常公雞睪丸參數(shù)即生精上皮長(zhǎng)，精細(xì)小管直徑、面積，約翰遜評(píng)分等。結(jié)果顯示低繁殖力組公雞睪丸重量、生精上皮長(zhǎng)、精細(xì)小管直徑、面積及約翰遜評(píng)分等睪丸參數(shù)顯著低于正常組。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，挑選出3只低繁殖力公雞及3只正常同胞公雞，作為iTRAQ試驗(yàn)樣本。
　　2.睪丸組織差異表達(dá)蛋白篩選、分析及驗(yàn)證。利用iTRAQ技術(shù)，對(duì)樣本睪丸組織總蛋白進(jìn)行相對(duì)及絕對(duì)定量分析。對(duì)iTRA

4、Q定量結(jié)果的分析，進(jìn)行低繁殖力和正常個(gè)體及組間的睪丸組織蛋白表達(dá)相互比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低繁殖力組上調(diào)倍數(shù)較大的蛋白為天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AspAT)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)蛋白和組蛋白H2A(Histone H2A)，下調(diào)倍數(shù)較大的蛋白有DNA損傷修復(fù)蛋白(DDB2)、T型中心粒蛋白(CENP-T)和G型蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPRG)。KEGGPathway富集分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白顯著富集于嘌呤和嘧啶的代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等信號(hào)通

5、路。利用蛋白免疫印跡法(Western Blotting)驗(yàn)證GST蛋白、AspAT蛋白和Histone H2A蛋白在低繁殖力組和正常組睪丸組織中表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)趨勢(shì)與iTRAQ技術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致。
　　綜合試驗(yàn)2結(jié)果，DDB2、CENP-Ⅰ、AspAT、GST、S100-A6和Histone H2A為調(diào)控精子發(fā)生的候選蛋白，其中AspAT、GST、DDB2和Histone H2A為重要候選蛋白。GnRH信號(hào)通路、嘌呤和嘧