腎母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物檢測(cè)與分期模型構(gòu)建研究.pdf

1、背景與目的： 腎母細(xì)胞瘤是兒童最常見的惡性腫瘤之一，全世界15歲以下兒童的發(fā)病率約為1/10，000。德國(guó)醫(yī)師Wilms于1899年首次報(bào)告此病，因此多數(shù)作者稱之為Wilms瘤。腎母細(xì)胞瘤是小兒最常見的由腎胚基發(fā)生的惡性腫瘤，2歲以下發(fā)病率最高。兒童惡性腫瘤的死亡率由20世紀(jì)80年代的8％上升到了10.7％，小兒腎母細(xì)胞瘤已經(jīng)成為小兒病死的主要原因之一。腎母細(xì)胞瘤的臨床病理分期和治療方法的選擇與患兒預(yù)后有直接的關(guān)系，NWTS在其

2、2001年的總結(jié)中提到：在目前的影像學(xué)技術(shù)條件下(依靠CT等)仍有7.0％的漏診率Ⅲ，主要是直徑小于3 c m的腎母細(xì)胞瘤。而表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization time of flight Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)是近年發(fā)展起來的一種新的蛋白質(zhì)研究技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)便、高通量及對(duì)多樣本平行檢驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，質(zhì)譜

3、技術(shù)及生物信息學(xué)方法的出現(xiàn)提供了有效篩選特異性標(biāo)記物的方法。Ciphergen公司研發(fā)的SELDI-TOF-MS技術(shù)是一項(xiàng)全新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，該技術(shù)通過應(yīng)用少量天然蛋白質(zhì)提取物來進(jìn)行快速分析，克服了傳統(tǒng)分析方法的局限性。具有樣品用量小、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)，已成功將其應(yīng)用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、直腸癌等惡性腫瘤的診斷、腫瘤標(biāo)志物的篩選及其他蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。本組應(yīng)用該技術(shù)在肝癌，甲狀腺癌及腎母細(xì)胞瘤前期研究中

4、獲得滿意效果。應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)和支持向量機(jī)(support vector machine，SVM)方法，篩選出腎母細(xì)胞瘤患兒特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物，建立腎母細(xì)胞瘤臨床分期血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型并與CT分期進(jìn)行對(duì)照分析。 材料與方法： (1)血清標(biāo)本共80例均來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科，其中術(shù)前腎母細(xì)胞瘤30例，其它小兒腹惡性實(shí)體腫瘤30例(神經(jīng)母細(xì)胞瘤16例，肝母細(xì)胞瘤4例，腎橫紋肌肉瘤4

5、例，惡性畸胎瘤4例，胰母細(xì)胞瘤2例)，正常對(duì)照組20例均來自體檢的健康小兒。 (2)樣本冰融，4℃10000 rpm離心2 min；取96孔板，放冰盒上，每孔加U9(9MUrea，2％CHAPS，1％DTT) 10μl，血清5μl，4℃層析柜600 rpm振蕩30 min；振蕩結(jié)束前15 min做芯片預(yù)處理，芯片裝入Bioprocessor中并記下芯片號(hào)；每孔加NaAC(100Mm，pH4)200μl，層析柜中600 rpm，5

6、min，重復(fù)1次；U9處理后96孔板放冰上，快速加入NaAC185μl在層析柜中6000 rpm振蕩2 min；加已處理好的樣本100μl到芯片，層析柜4℃600 rpm振蕩1 h，甩干，重復(fù)3次；用hplc水200μl洗2次快速甩干；用50％飽和的SPA 1μl重復(fù)2次；上機(jī)檢測(cè)；將芯片放入Ciphergen讀譜儀中檢測(cè)。 (3)用protein chip software 3.1做校正，使總離子的強(qiáng)度及分子量均一化。應(yīng)用ZU

7、CI-Protein Chip Data Analyze System軟件包進(jìn)行分析。原始數(shù)據(jù)用離散小波(undecimated discrete wavelet transform)分析去除噪音，并減掉基線。聚類分析以10％為最小閾值，將各個(gè)樣本中m/z的差異小于0.3％的峰聚為一類。支持向量機(jī)(support vector machine，SVM)特征向量的選取采用統(tǒng)計(jì)過濾結(jié)合模型依賴性篩選的方法建立判別模型，用留一法交叉驗(yàn)證作為評(píng)

8、估模型判別效果。 (4).統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有的蛋白質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾掉信躁和聚類分析處理后，對(duì)所有初步篩選出的質(zhì)荷比峰做Wileonxon秩和檢驗(yàn)，選出p值最小的10個(gè)峰進(jìn)一步分析。將10個(gè)峰的任意組合(共175種組合)用于支持向量機(jī)模型的輸入，用留一法評(píng)估模型的預(yù)測(cè)效果，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)α=0.01 結(jié)果1.腎母細(xì)胞瘤Ⅰ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期組腎母細(xì)胞瘤Ⅰ期組和腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到483個(gè)M/Z峰，對(duì)其

9、相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰5個(gè)，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型，篩選出M/Z位于7965.4、5022.4和8469.6的標(biāo)志物3個(gè)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期低表達(dá)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅰ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗(yàn)，在測(cè)試集上判別模型的敏感性為100％，特異性為100％。 2.腎母細(xì)胞瘤Ⅰ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組

10、腎母細(xì)胞瘤Ⅰ組和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到496個(gè)M/Z峰，對(duì)其相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰4個(gè)，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型，篩選出M/Z位于4263.1、4122.8、4330.7和4303.7的標(biāo)志物4個(gè)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組低表達(dá)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅰ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗(yàn)，在測(cè)試集

11、上判別模型的敏感性為100.00％，特異性為100.00％。 3.腎母細(xì)胞瘤Ⅰ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組腎母細(xì)胞瘤Ⅰ組和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到565個(gè)M/Z峰，對(duì)其相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰4個(gè)，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型，篩選出M/Z位于10836.6和8179.1的標(biāo)志物2個(gè)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期低

12、表達(dá)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅰ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗(yàn)，在測(cè)試集上判別模型的敏感性為88.89％，特異性為100.00％。 4.腎母細(xì)胞瘤Ⅱ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組腎母細(xì)胞瘤Ⅱ組和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到490個(gè)M/Z峰，對(duì)其相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰3個(gè)，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組

13、合模型，篩選出M/Z位于5019.2和4143.2的標(biāo)志物2個(gè)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期組低表達(dá)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗(yàn)，在測(cè)試集上判別模型的敏感性為88.89％，特異性為100.00％。 5.腎母細(xì)胞瘤Ⅱ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組腎母細(xì)胞瘤Ⅱ組和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到508個(gè)M/Z峰，對(duì)其相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰20個(gè)，從

14、差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型，篩選出M/Z位于7976.5的標(biāo)志物1個(gè)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組低表達(dá)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅱ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗(yàn)，在測(cè)試集上判別模型的敏感性為100.00％，特異性為100.00％。 6.腎母細(xì)胞瘤Ⅲ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組腎母細(xì)胞瘤Ⅲ組和腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到504個(gè)M/Z峰，對(duì)其相對(duì)強(qiáng)

15、度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰12個(gè)，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型，篩選出M/Z位于8194.4的標(biāo)志物1個(gè)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅳ期組低表達(dá)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅲ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗(yàn)，在測(cè)試集上判別模型的敏感性為93.75％，特異性為100,00％。 7.腎母細(xì)胞瘤Ⅰ+Ⅱ腎母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ+Ⅳ期組腎母

16、細(xì)胞瘤Ⅰ+Ⅱ期組和腎母細(xì)胞瘤Ⅲ+Ⅳ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到519個(gè)M/Z峰，對(duì)其相對(duì)強(qiáng)度做Wilconxon秩和檢驗(yàn)分析得到P值小于0.01的M/Z峰3個(gè)，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型，篩選出M/Z位于4153.9,3257.6和3290.7的標(biāo)志物3個(gè)，在腎母細(xì)胞瘤組Ⅲ+Ⅳ期低表達(dá)，在腎母細(xì)胞瘤Ⅰ+Ⅱ期高表達(dá)。聯(lián)合兩個(gè)潛在標(biāo)記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗(yàn)，在測(cè)試集

17、上判別模型的敏感性為83.33％，特異性為93.75％。 8.臨床各分期的對(duì)照：通過腎母細(xì)胞瘤早期診斷模型中的2個(gè)m/z(6984.4，6455.5)血清標(biāo)記物進(jìn)行分析得出腎母細(xì)胞瘤各期情況如下：Ⅳ期相對(duì)于Ⅲ期低表達(dá)；Ⅲ期相對(duì)于Ⅱ期低表達(dá)：Ⅱ期相對(duì)于Ⅰ期低表達(dá)；Ⅰ期相對(duì)于正常兒童低表達(dá)；后者相對(duì)高表達(dá)；臨床分期越晚M/Z強(qiáng)度就越低表達(dá)。 9.盲法驗(yàn)證CT與蛋白質(zhì)芯片分期的準(zhǔn)確性：蛋白芯片分期如下：Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ