腎母細胞瘤血清蛋白質(zhì)標記物檢測與分期模型構建研究.pdf

1、背景與目的： 腎母細胞瘤是兒童最常見的惡性腫瘤之一，全世界15歲以下兒童的發(fā)病率約為1/10，000。德國醫(yī)師Wilms于1899年首次報告此病，因此多數(shù)作者稱之為Wilms瘤。腎母細胞瘤是小兒最常見的由腎胚基發(fā)生的惡性腫瘤，2歲以下發(fā)病率最高。兒童惡性腫瘤的死亡率由20世紀80年代的8％上升到了10.7％，小兒腎母細胞瘤已經(jīng)成為小兒病死的主要原因之一。腎母細胞瘤的臨床病理分期和治療方法的選擇與患兒預后有直接的關系，NWTS在其

2、2001年的總結中提到：在目前的影像學技術條件下(依靠CT等)仍有7.0％的漏診率Ⅲ，主要是直徑小于3 c m的腎母細胞瘤。而表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜技術(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization time of flight Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)是近年發(fā)展起來的一種新的蛋白質(zhì)研究技術，具有快速、簡便、高通量及對多樣本平行檢驗的優(yōu)點，質(zhì)譜

3、技術及生物信息學方法的出現(xiàn)提供了有效篩選特異性標記物的方法。Ciphergen公司研發(fā)的SELDI-TOF-MS技術是一項全新的蛋白質(zhì)組學研究方法，該技術通過應用少量天然蛋白質(zhì)提取物來進行快速分析，克服了傳統(tǒng)分析方法的局限性。具有樣品用量小、操作簡便、靈敏度高、高通量等優(yōu)點，已成功將其應用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、直腸癌等惡性腫瘤的診斷、腫瘤標志物的篩選及其他蛋白質(zhì)組學研究中。本組應用該技術在肝癌，甲狀腺癌及腎母細胞瘤前期研究中

4、獲得滿意效果。應用SELDI-TOF-MS技術結合生物信息學和支持向量機(support vector machine，SVM)方法，篩選出腎母細胞瘤患兒特異性蛋白質(zhì)標記物，建立腎母細胞瘤臨床分期血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型并與CT分期進行對照分析。 材料與方法： (1)血清標本共80例均來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院小兒外科，其中術前腎母細胞瘤30例，其它小兒腹惡性實體腫瘤30例(神經(jīng)母細胞瘤16例，肝母細胞瘤4例，腎橫紋肌肉瘤4

5、例，惡性畸胎瘤4例，胰母細胞瘤2例)，正常對照組20例均來自體檢的健康小兒。 (2)樣本冰融，4℃10000 rpm離心2 min；取96孔板，放冰盒上，每孔加U9(9MUrea，2％CHAPS，1％DTT) 10μl，血清5μl，4℃層析柜600 rpm振蕩30 min；振蕩結束前15 min做芯片預處理，芯片裝入Bioprocessor中并記下芯片號；每孔加NaAC(100Mm，pH4)200μl，層析柜中600 rpm，5

6、min，重復1次；U9處理后96孔板放冰上，快速加入NaAC185μl在層析柜中6000 rpm振蕩2 min；加已處理好的樣本100μl到芯片，層析柜4℃600 rpm振蕩1 h，甩干，重復3次；用hplc水200μl洗2次快速甩干；用50％飽和的SPA 1μl重復2次；上機檢測；將芯片放入Ciphergen讀譜儀中檢測。 (3)用protein chip software 3.1做校正，使總離子的強度及分子量均一化。應用ZU

7、CI-Protein Chip Data Analyze System軟件包進行分析。原始數(shù)據(jù)用離散小波(undecimated discrete wavelet transform)分析去除噪音，并減掉基線。聚類分析以10％為最小閾值，將各個樣本中m/z的差異小于0.3％的峰聚為一類。支持向量機(support vector machine，SVM)特征向量的選取采用統(tǒng)計過濾結合模型依賴性篩選的方法建立判別模型，用留一法交叉驗證作為評

8、估模型判別效果。 (4).統(tǒng)計學分析所有的蛋白質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾掉信躁和聚類分析處理后，對所有初步篩選出的質(zhì)荷比峰做Wileonxon秩和檢驗，選出p值最小的10個峰進一步分析。將10個峰的任意組合(共175種組合)用于支持向量機模型的輸入，用留一法評估模型的預測效果，檢驗標準設α=0.01 結果1.腎母細胞瘤Ⅰ腎母細胞瘤和腎母細胞瘤Ⅱ期組腎母細胞瘤Ⅰ期組和腎母細胞瘤Ⅱ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到483個M/Z峰，對其

9、相對強度做Wilconxon秩和檢驗分析得到P值小于0.01的M/Z峰5個，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預測值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型，篩選出M/Z位于7965.4、5022.4和8469.6的標志物3個，在腎母細胞瘤Ⅱ期低表達，在腎母細胞瘤Ⅰ期高表達。聯(lián)合兩個潛在標記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗，在測試集上判別模型的敏感性為100％，特異性為100％。 2.腎母細胞瘤Ⅰ腎母細胞瘤和腎母細胞瘤Ⅲ期組

10、腎母細胞瘤Ⅰ組和腎母細胞瘤Ⅲ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到496個M/Z峰，對其相對強度做Wilconxon秩和檢驗分析得到P值小于0.01的M/Z峰4個，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預測值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型，篩選出M/Z位于4263.1、4122.8、4330.7和4303.7的標志物4個，在腎母細胞瘤Ⅲ期組低表達，在腎母細胞瘤Ⅰ期高表達。聯(lián)合兩個潛在標記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗，在測試集

11、上判別模型的敏感性為100.00％，特異性為100.00％。 3.腎母細胞瘤Ⅰ腎母細胞瘤和腎母細胞瘤Ⅳ期組腎母細胞瘤Ⅰ組和腎母細胞瘤Ⅳ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到565個M/Z峰，對其相對強度做Wilconxon秩和檢驗分析得到P值小于0.01的M/Z峰4個，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預測值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型，篩選出M/Z位于10836.6和8179.1的標志物2個，在腎母細胞瘤Ⅳ期低

12、表達，在腎母細胞瘤Ⅰ期高表達。聯(lián)合兩個潛在標記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗，在測試集上判別模型的敏感性為88.89％，特異性為100.00％。 4.腎母細胞瘤Ⅱ腎母細胞瘤和腎母細胞瘤Ⅲ期組腎母細胞瘤Ⅱ組和腎母細胞瘤Ⅲ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到490個M/Z峰，對其相對強度做Wilconxon秩和檢驗分析得到P值小于0.01的M/Z峰3個，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預測值的約登(youden)指數(shù)最高的組

13、合模型，篩選出M/Z位于5019.2和4143.2的標志物2個，在腎母細胞瘤Ⅲ期組低表達，在腎母細胞瘤Ⅱ期高表達。聯(lián)合兩個潛在標記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗，在測試集上判別模型的敏感性為88.89％，特異性為100.00％。 5.腎母細胞瘤Ⅱ腎母細胞瘤和腎母細胞瘤Ⅳ期組腎母細胞瘤Ⅱ組和腎母細胞瘤Ⅳ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到508個M/Z峰，對其相對強度做Wilconxon秩和檢驗分析得到P值小于0.01的M/Z峰20個，從

14、差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預測值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型，篩選出M/Z位于7976.5的標志物1個，在腎母細胞瘤Ⅳ期組低表達，在腎母細胞瘤Ⅱ期高表達。聯(lián)合兩個潛在標記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗，在測試集上判別模型的敏感性為100.00％，特異性為100.00％。 6.腎母細胞瘤Ⅲ腎母細胞瘤和腎母細胞瘤Ⅳ期組腎母細胞瘤Ⅲ組和腎母細胞瘤Ⅳ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到504個M/Z峰，對其相對強

15、度做Wilconxon秩和檢驗分析得到P值小于0.01的M/Z峰12個，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預測值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型，篩選出M/Z位于8194.4的標志物1個，在腎母細胞瘤Ⅳ期組低表達，在腎母細胞瘤Ⅲ期高表達。聯(lián)合兩個潛在標記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗，在測試集上判別模型的敏感性為93.75％，特異性為100,00％。 7.腎母細胞瘤Ⅰ+Ⅱ腎母細胞瘤和腎母細胞瘤Ⅲ+Ⅳ期組腎母

16、細胞瘤Ⅰ+Ⅱ期組和腎母細胞瘤Ⅲ+Ⅳ期的質(zhì)譜經(jīng)過初步過濾篩選得到519個M/Z峰，對其相對強度做Wilconxon秩和檢驗分析得到P值小于0.01的M/Z峰3個，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預測值的約登(youden)指數(shù)最高的組合模型，篩選出M/Z位于4153.9,3257.6和3290.7的標志物3個，在腎母細胞瘤組Ⅲ+Ⅳ期低表達，在腎母細胞瘤Ⅰ+Ⅱ期高表達。聯(lián)合兩個潛在標記物作為輸入值，用留一法交叉檢驗，在測試集

17、上判別模型的敏感性為83.33％，特異性為93.75％。 8.臨床各分期的對照：通過腎母細胞瘤早期診斷模型中的2個m/z(6984.4，6455.5)血清標記物進行分析得出腎母細胞瘤各期情況如下：Ⅳ期相對于Ⅲ期低表達；Ⅲ期相對于Ⅱ期低表達：Ⅱ期相對于Ⅰ期低表達；Ⅰ期相對于正常兒童低表達；后者相對高表達；臨床分期越晚M/Z強度就越低表達。 9.盲法驗證CT與蛋白質(zhì)芯片分期的準確性：蛋白芯片分期如下：Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ