干細(xì)胞因子Oct4在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其功能和機(jī)制的研究.pdf

1、肝癌(主要是肝細(xì)胞癌,hepatocellular carcinoma,HCC)的預(yù)后較差。目前,手術(shù)切除仍為肝癌最有效的治療方法。但即使根治性切除,5年內(nèi)仍有60％～70％的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率。轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為進(jìn)一步延長(zhǎng)肝癌病人生存期、提高遠(yuǎn)期療效的瓶頸問(wèn)題,也是最終攻克肝癌的關(guān)鍵所在。
　　越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤干細(xì)胞由于具有自我更新、產(chǎn)生和維持腫瘤生長(zhǎng)和導(dǎo)致細(xì)胞異質(zhì)性的原始細(xì)胞及分化細(xì)胞的能力,是腫瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)的根源。腫瘤干細(xì)胞和其它

2、成體干細(xì)胞高度相似,學(xué)者推測(cè)干細(xì)胞在體內(nèi)通過(guò)長(zhǎng)期的積累突變而獲得不確定的增殖能力進(jìn)而轉(zhuǎn)化為腫瘤干細(xì)胞。因此在分子調(diào)控水平研究干細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞發(fā)展的分子機(jī)制,有利于探索早期診斷和徹底治療肝癌的新方法。
　　研究發(fā)現(xiàn)Oct4、Sox2和Nanog在早期胚胎干細(xì)胞發(fā)育分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,其通過(guò)調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄,從而維持其多潛能性和自我更新的能力。
　　本課題首先研究此三個(gè)干細(xì)胞相關(guān)因子在HCC中的表達(dá)水平變化,并在此

3、基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究Oct4的表達(dá)對(duì)肝癌以及肝癌干細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能機(jī)制。
　　第一部分：肝細(xì)胞癌中干細(xì)胞相關(guān)因子Oct4,Sox2和Nanog的表達(dá)水平及其與腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的關(guān)系
　　一、免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝細(xì)胞癌組織中干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Oct4,Sox2和Nanog的表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系。
　　[目的]檢測(cè)HCC組織中干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Oct4,Sox2和Nanog的表達(dá)情況,評(píng)價(jià)相關(guān)因子對(duì)肝癌術(shù)后復(fù)

4、發(fā)及生存的影響。
　　[方法]用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)126例肝癌組織進(jìn)行分析。研究Oct4,Sox2和Nanog在肝癌中的表達(dá)情況和并結(jié)合患者的病理資料分析了其表達(dá)水平與肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的相關(guān)性。
　　[結(jié)果]在HCC腫瘤組織中檢測(cè)到了Oct4和Sox2的表達(dá),但是沒(méi)有檢測(cè)到Nanog的表達(dá)。
　　Oct4在HCC中主要分布在癌巢內(nèi),80例病人染色陽(yáng)性(63.5％),9例病人癌旁染色陽(yáng)性(7.1％);在癌巢內(nèi),O

5、ct4特異性著色在細(xì)胞核內(nèi),染色明顯;統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)Oct4的表達(dá)與肝癌術(shù)后生存及復(fù)發(fā)無(wú)明顯相關(guān)性。Oct4的表達(dá)與患者的年齡,性別,甲胎蛋白,肝硬化,腫瘤大小,包膜有無(wú),血管侵犯和腫瘤分化情況均為明顯相關(guān)性。
　　Sox2在HCC的分布有兩種情況:一種情況是特異性表達(dá)在細(xì)胞膜上,在陽(yáng)性染色區(qū)域,可見(jiàn)細(xì)胞輪廓呈現(xiàn)明顯的深棕色,胞漿胞核和細(xì)胞間質(zhì)無(wú)明顯著色;另一種情況就是特異性的表達(dá)在胞漿,呈顆粒狀聚集、簇狀分布在胞核附近。癌旁組織內(nèi)

6、有Sox2均勻的非特異性著色;癌組織內(nèi)Sox2在細(xì)胞膜上的表達(dá)與肝癌術(shù)后生存和復(fù)發(fā)沒(méi)有明顯的相關(guān)性;Sox2在癌巢胞漿的表達(dá)與總生存沒(méi)有明顯相關(guān)性(p=0.871),與至復(fù)發(fā)時(shí)間明顯相關(guān)(p=0.012),癌組織胞漿內(nèi)Sox2陰性患者的至復(fù)發(fā)時(shí)間明顯比Sox2陽(yáng)性的患者要長(zhǎng)。Sox2的表達(dá)情況與患者的年齡,性別,甲胎蛋白,肝硬化等臨床病理學(xué)特征沒(méi)有明顯相關(guān)性。
　　[結(jié)論]HCC組織中Oct4和Sox2的表達(dá)水平明顯上調(diào),且與HC

7、C預(yù)后有關(guān)。
　　二、Taqman探針?lè)?yàn)證Oct4和Sox2在HCC病人中的mRNA水平表達(dá)。
　　[目的]鑒于肝癌組織結(jié)構(gòu)和病理特征的復(fù)雜性,利用免疫組化方法明確的判定肝臟癌組織和癌旁組織有一定的難度,所以,我們利用特異性Taqman探針引物實(shí)時(shí)定量PCR,檢測(cè)HCC中Oct4和Sox2的mRNA表達(dá)水平。檢測(cè)Oct4和sox2在HCC配對(duì)的癌和癌旁中的的表達(dá)水平差異,探討Oct4和Sox2與HCC的關(guān)系。
　　[

8、方法](1)提取HCC組織的總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。(2)使用特異性Taqman探針引物實(shí)時(shí)定量PCR,檢測(cè)HCC中Oct4和Sox2的InRNA表達(dá)水平。
　　[結(jié)果]與免疫組化的結(jié)果一致,Oct4主要在癌組織中表達(dá)(p=0.0157);驗(yàn)證了Sox2免疫組化結(jié)果中癌旁的均勻著色為非特異性的背景染色,Sox2主要在癌組織中表達(dá)(p=0.022)
　　[結(jié)論]Oct4和Sox2在HCC癌組織中的mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁組織

9、。
　　三、不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系中Oct4和Sox2的表達(dá)水平
　　[目的]研究Oct4和Sox2在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系的表達(dá)水平,進(jìn)一步驗(yàn)證其在肝癌發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮的作用。
　　[方法](1)選取并培養(yǎng)不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系Bel-7402,SMMC-7721,PLC/PRF、HepG2,MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3。(2)提取各細(xì)胞系的總RNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,并應(yīng)用TaqMan(R)

10、MGB探針?lè)▽?duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)。(3)提取各細(xì)胞系的總蛋白,利用Western Blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。(4)利用細(xì)胞免疫熒光對(duì)Oct4和Sox2進(jìn)行定位檢測(cè)。
　　[結(jié)果](1)mRNA和蛋白質(zhì)水平上的檢測(cè)都發(fā)現(xiàn)Oct4在PLC/PRF、HepG2,MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3這五種細(xì)胞系中都有表達(dá),而且表達(dá)水平是隨著其侵襲轉(zhuǎn)移能力增加而逐漸增強(qiáng),差異顯著(P＜0.001)(2)mRNA和蛋白質(zhì)水平上的檢測(cè)

11、發(fā)現(xiàn)Sox2在HCC細(xì)胞中的表達(dá)都很低,但是在具有轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞MHCC97-L和MHCC97-H的表達(dá)明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移潛能的Bel-7402,SMMC-7721,PLC/PRF和HepG2(P＜0.001)。(3)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Oct4主要定位在細(xì)胞核,和之前的免疫組化結(jié)果一致:Sox2在細(xì)胞的胞膜,胞漿和胞核都有表達(dá)。
　　[結(jié)論]利用肝癌細(xì)胞系進(jìn)一步證實(shí)Oct4和Sox2可能在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。并根據(jù)Oct4的

12、表達(dá)情況,選取PLC/PRF,HepG2和HCCLM3進(jìn)行下一步Oct4功能和機(jī)制研究。
　　第二部分：Oct4對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究
　　一、載體構(gòu)建、載體轉(zhuǎn)染/侵染和穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選
　　[目的]構(gòu)建Oct4過(guò)表達(dá)載體,篩選表達(dá)Oct4的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株;包裝5個(gè)Oct4的慢病毒shRNA干擾載體PLK0.1,挑選干擾效果最好的shRNA干擾載體,挑單克隆,篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。
　　[方法]根據(jù)第一部

13、分對(duì)HCC細(xì)胞系中Oct4蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)結(jié)果,我們選取了Oct4基礎(chǔ)表達(dá)水平低的HepG2細(xì)胞和PLC/PRF,通過(guò)轉(zhuǎn)染Oct4表達(dá)質(zhì)粒,獲得Oct4過(guò)表達(dá)細(xì)胞;選擇Oct4基礎(chǔ)表達(dá)水平高的HCCLM3,通過(guò)基因沉默阻斷其表達(dá),通過(guò)正反兩個(gè)方面研究其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。(1)構(gòu)建Oct4過(guò)表達(dá)載體,并將其和對(duì)照空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Oct4低表達(dá)肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF和HepG2,利用Hygromyein篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。(2)

14、包裝5個(gè)Oct4的shRNA干擾載體PLK0.1和scramble的對(duì)照,侵染LM3后,挑選出干擾效果最好的shRNA。(3)將干擾效果最好的shRNA慢病毒侵染LM3和HepG2,利用Puromyein來(lái)挑單克隆,篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。
　　[結(jié)果]經(jīng)測(cè)序證實(shí)構(gòu)建的Oct4過(guò)表達(dá)載體的序列正確,讀碼框無(wú)誤;RealTimePCR和Westernblot檢測(cè)過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株Oct4的表達(dá)上調(diào)了5倍;同時(shí)檢測(cè)5種shRNA慢病毒載體的干擾

15、效率,并選取干擾效果最好的a5shRNA進(jìn)行單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選,篩選出細(xì)胞克隆a5-2的基因沉默效果最好,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定細(xì)胞株a5-2的Oct4下調(diào)65％。所以選取a5-2作為研究Oct4機(jī)制功能檢測(cè)的基因沉默細(xì)胞株。
　　[結(jié)論]成功構(gòu)建并篩選出Oct4過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株和空載對(duì)照細(xì)胞株,以及Oct4基因沉默細(xì)胞株和對(duì)應(yīng)的scramble對(duì)照細(xì)胞株。
　　二、Oct4對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　[目的]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)

16、觀察Oct4過(guò)表達(dá)和基因沉默對(duì)HCC細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲、粘附以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化和抗化療能力的影響;通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)裸鼠人肝癌模型進(jìn)一步驗(yàn)證Oct4過(guò)表達(dá)對(duì)于HepG2成瘤能力的影響。
　　[方法]根據(jù)第一部分對(duì)HCC細(xì)胞系中Oct4蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)結(jié)果,我們選取了Oct4基礎(chǔ)表達(dá)水平低的HepG2細(xì)胞和PLC/PRF,通過(guò)轉(zhuǎn)染Oct4表達(dá)質(zhì)粒,獲得Oct4過(guò)表達(dá)細(xì)胞;選擇Oct4基礎(chǔ)表達(dá)水平高的HCCLM3,通過(guò)基因沉默阻

17、斷其表達(dá),通過(guò)正反兩個(gè)方面研究其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。采用ANNEXINV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、CyQUANT細(xì)胞增殖試劑盒、Matrigel膠和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)分別比較Oct4過(guò)表達(dá)和基因沉默后肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡,細(xì)胞增殖、粘附、運(yùn)動(dòng)、侵襲能力及細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的變化;將Oct4過(guò)表達(dá)和空載對(duì)照的HepG2細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞株(1×107/只)分別進(jìn)行裸鼠皮下接種,每周兩次觀察并記錄裸鼠的成瘤情況;裸鼠皮下接種四周后,處死裸鼠進(jìn)行拍

18、照;利用細(xì)胞增殖檢測(cè)Oct4對(duì)HCC化療藥物敏感性的影響。
　　[結(jié)果]流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,Oct4過(guò)表達(dá)和基因沉默的細(xì)胞其凋亡情況都沒(méi)有明顯的差異(P=0.24);Oct4過(guò)表達(dá)的HepG2細(xì)胞增殖能力明顯高于對(duì)照組(P＜0.001);而Oct4基因沉默的HCCLM3細(xì)胞,其增殖能力則明顯低于對(duì)照組(P＜0.001);Oct4過(guò)表達(dá)的HepG2細(xì)胞與對(duì)照組相比,細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力和粘附能力無(wú)顯著差異。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)

19、Oct4過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株穿過(guò)過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)(150.2±10.1)明顯多于對(duì)照質(zhì)粒組的HepG2穿膜的細(xì)胞數(shù)(62.3+8.4):Oct4過(guò)表達(dá)的HepG2細(xì)胞在軟瓊脂膠中形成的克隆數(shù)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);在5-Fu作用下,Oct4過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株的增殖能力明顯高于對(duì)照細(xì)胞,接近于無(wú)5-Fu無(wú)處理的細(xì)胞(P＜0.001)。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),和對(duì)照組相比,Oct4過(guò)表達(dá)組的裸鼠皮下瘤增長(zhǎng)更快,其增長(zhǎng)曲線明顯高于對(duì)照

20、組:腫瘤細(xì)胞裸鼠皮下接種第四周,對(duì)照組的裸鼠皮下瘤體積為1.769±0.235mm3,而Oct4過(guò)表達(dá)組0.589±0.18cm3,差異顯著(P=0.0011)
　　[結(jié)論]體外實(shí)驗(yàn)表明,Oct4可以促進(jìn)細(xì)胞增殖,增加細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)化能力,提高HCC細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗能力;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,Oct4可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤。
　　三、Oct4影響HCC細(xì)胞生物活性的機(jī)制研究
　　[目的]研究Oct4過(guò)表達(dá)對(duì)肝

21、癌干細(xì)胞標(biāo)記物Epcam、Vimentin、ELF和KLF4、CD44和CD133表達(dá)的影響;研究Oct4過(guò)表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞抗藥性的影響;探討Oct4對(duì)腫瘤和干細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路(IL-6/survivin、TGF-beta/和Wnt/beta-catenin)的影響。
　　[方法](1)采用Werstemblot和Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路和干細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路的變化。(2)采用RT-PCR分析腫瘤干細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)情況。

22、(3)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44和CD133陽(yáng)性的細(xì)胞。(4)利用Werstemblot檢測(cè)Oct4過(guò)表達(dá)的細(xì)胞與5-Fu抗性細(xì)胞信號(hào)通路的表達(dá)情況。
　　[結(jié)果](1)Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Oct4過(guò)表達(dá)后,磷酸化的AKT、JAK、stat3和ERK其表達(dá)水平明顯增高,Survivin、OPN以及beta-catenin的表達(dá)也是上調(diào)的,但是E-cadeherin的表達(dá)是下降的。(2)Elisa檢測(cè)了腫瘤相關(guān)分泌蛋

23、白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)IL-6、MPP2和MPP9的表達(dá)是上調(diào)的,TGF-beta的表達(dá)下調(diào)。(3)RT-PCR結(jié)果表明,Oct4過(guò)表達(dá)后,Vimentin、ELF和KLF4等干細(xì)胞因子的表達(dá)水平顯著升高。(4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Oct4過(guò)表達(dá)后,CDl33,CD44陽(yáng)性的細(xì)胞明顯增加。(5)和對(duì)照細(xì)胞相比,Oct4過(guò)表達(dá)的細(xì)胞與5-Fu抗性細(xì)胞表達(dá)的主要信號(hào)分子是一致的。
　　[結(jié)論]Oct4可能通過(guò)上調(diào)干細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路,誘導(dǎo)生成更