Oct4在富集腫瘤干細(xì)胞的結(jié)直腸耐藥細(xì)胞株中抗凋亡作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分人結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞株的建立及特性
　　 目的:建立穩(wěn)定的人結(jié)直腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株，并檢測其部分特性，為后續(xù)實驗打下基礎(chǔ)。
　　 方法:(1)在兩種人結(jié)直腸癌細(xì)胞株（SW480、SW620，稱之為親本細(xì)胞）的培養(yǎng)液中，通過逐漸提高化療藥物奧沙利鉑(Oxa)的濃度，建立穩(wěn)定的耐Oxa細(xì)胞株（SW480/OxR、SW620/OxR，稱之為耐藥細(xì)胞）;(2)與親本細(xì)胞比較，采用以下方法檢測耐藥細(xì)胞株的一些生物學(xué)特性:采

2、用WST-1試劑檢測兩種細(xì)胞對化療藥物Oxa和5-FU的敏感性;采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測MDR-1、Survivin及Oct4mRNA表達(dá)水平;采用流式間接法檢測耐藥相關(guān)蛋白(P-gp和S urvivin)表達(dá)情況;采用流式直接法檢測腫瘤干細(xì)胞(CSCs)標(biāo)記物CD44、CD133的表達(dá)情況;比較耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞接種NOD/SCID小鼠后成瘤能力的變化;采用Western blot方法檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)記

3、物(E-ca、N-ca、Vim)及Oct4蛋白的變化。
　　 結(jié)果:細(xì)胞增殖試劑WST-1檢測細(xì)胞增殖情況結(jié)果為:親本細(xì)胞加藥（Oxa及5-FU）72h后細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.01），而耐藥細(xì)胞加藥后細(xì)胞數(shù)量變化不大(P＞0.05);耐藥細(xì)胞MDR-1、Survivin及Oct4mRNA表達(dá)水平較親本細(xì)胞明顯增高（P＜0.01）;耐藥細(xì)胞中P-gp+及Survivin+細(xì)胞比例較親本細(xì)胞明顯增高（P＜0.01）;耐藥細(xì)胞中C

4、SCs標(biāo)記物（CD133+及CD44+）表達(dá)比例明顯增多;耐藥細(xì)胞在NOD/SCID小鼠的致瘤性明顯增強(qiáng);SW620/OxR細(xì)胞相對于SW620細(xì)胞，間質(zhì)標(biāo)記物(N-ca及Vim)蛋白表達(dá)明顯增高（P＜0.05及P＜0.01），而上皮標(biāo)記物(E-ca)蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）;耐藥細(xì)胞Oct4mRNA及蛋白水平均明顯高于親本細(xì)胞(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:耐藥細(xì)胞相對于親本細(xì)胞具有以下特性:多藥耐藥特性;EMT特

5、性（SW620/OxR細(xì)胞相對于SW620細(xì)胞）;高表達(dá)CSCs標(biāo)記物（CD133及CD44）;NOD/SCID小鼠致瘤性增強(qiáng);高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct4;說明耐藥細(xì)胞富集CSCs并高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct4。
　　 第二部分Oct4-shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定（外篩內(nèi)驗）
　　 目的:構(gòu)建能夠有效沉默Oct4基因的Oct4-shRNA慢病毒載體，在人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞驗證其對Oct4的抑制效率及其對細(xì)胞凋亡的影響，并

6、探討其可能機(jī)制。
　　 方法:(1)構(gòu)建針對Oct4的4個Oct4-shRNA干擾慢病毒載體質(zhì)粒（干擾序列分別稱為pSC-1、pSC-2、pSC-3、pSC-4），用Oct4與GFP融合的過表達(dá)質(zhì)粒分別與4個干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（稱之為外源篩靶實驗），采用Western blot檢測GFP的表達(dá)，篩選出干擾效果最好的Oct4-shRNA慢病毒載體，用293T細(xì)胞包裝;(2)轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的實驗（稱之為內(nèi)源驗證

7、實驗）:實驗分3組:①空白對照組(Con):不轉(zhuǎn)染慢病毒，②陰性對照組(NC):轉(zhuǎn)染陰性對照慢病毒，③RNA干擾組(RNAi):轉(zhuǎn)染Oct4-shRNA慢病毒載體;對上述3組采用RT-qPCR檢測Oct4-mRNA，Western blot檢測Oct4、p-Akt蛋白，流式細(xì)胞儀測定Oct4+、CD44+細(xì)胞比例及腫瘤細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:(1)在293T細(xì)胞的外源篩靶實驗結(jié)果提示，含pSC-2干擾序列的Oct4-shRN

8、A慢病毒載體質(zhì)粒干擾效果最好（GFP蛋白表達(dá)量明顯減少）;(2)在SW480細(xì)胞的內(nèi)源驗證結(jié)果提示，與Con組及NC組比較，RNAi組SW480細(xì)胞Oct4的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降(P＜0.01)，CD44+細(xì)胞比例明顯減少，p-Akt蛋白明顯受抑制（P＜0.01），細(xì)胞凋亡明顯增加（P＜0.01），而Con組與NC組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:我們成功構(gòu)建了能夠有效沉默Oct4基因的Oct4-shR

9、NA慢病毒載體，用其沉默Oct4基因可明顯減少SW480細(xì)胞中CD44+細(xì)胞比例，增加細(xì)胞凋亡，其作用可能與PI3K/Akt通路有關(guān)。
　　 第三部分Oct4在富集腫瘤干細(xì)胞的結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞中抗凋亡作用及機(jī)制研究
　　 目的:明確Oct4在富集CSCs的人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株中是否具有抗凋亡作用，并探討其作用是否與S TAT3/Survivin通路有關(guān)。
　　 方法:(1)采用Western blot方法比較STA

10、T3、磷酸化STAT3(P-STAT3)及Survivin蛋白在耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞的表達(dá)情況;采用免疫熒光法檢測Oct4與P-STAT3在耐藥細(xì)胞中的共表達(dá)情況。(2)Oct4-shRNA慢病毒載體沉默耐藥細(xì)胞(SW480/OxR和SW620/OxR)Oct4基因的實驗:兩種細(xì)胞均分以下2組:①陰性對照組(NC):轉(zhuǎn)染陰性對照慢病毒，②RNA干擾組(RNAi):轉(zhuǎn)染Oct4-shRNA慢病毒載體;對上述2組采用RT-qPCR檢測Oct4

11、、STAT3及Survivin-mRNA變化;Western blot檢測Oct4、STAT3、P-STAT3及Survivin蛋白的變化;采用流式直接法檢測CSCs標(biāo)記物CD44、CD133的變化;比較細(xì)胞接種NOD/SCID小鼠后成瘤能力的變化;采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化。
　　 結(jié)果:耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞比較，STAT3、P-STAT3及Survivin蛋白表達(dá)明顯增高（P＜0.01或P＜0.05）;Oct4與P-S

12、TAT3(pY705)蛋白在耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞中均共表達(dá)于細(xì)胞核，耐藥細(xì)胞表達(dá)較親本細(xì)胞明顯增強(qiáng);Oct4-shRNA慢病毒載體沉默耐藥細(xì)胞Oct4基因后，STAT3及Survivin-mRNA水平明顯降低（P＜0.01），STAT3、P-STAT3及Survivin蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.01），腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD44+、CD133+細(xì)胞比例明顯下降，細(xì)胞凋亡明顯增加，NOD/SCID小鼠致瘤性明顯減弱，腫瘤生長明顯受抑制（P＜0