精子發(fā)生相關蛋白Stra8與Setd8的相互作用研究.pdf

1、Stra8(stimulated by retinoic acid gene8)是一種視黃酸(retinoic acid,RA)反應基因，在成年小鼠睪丸中特異性表達，同時其蛋白在睪丸中的表達具有階段和細胞特異性。Stra8對于精子發(fā)生的過程是至關重要的。Stra8基因敲除的雄性小鼠不育，精子發(fā)生過程受到嚴重影響。本實驗室在前期工作中以Stra8蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交技術從小鼠精原干細胞cDNA文庫中篩選與Stra8相互作用的蛋白，結

2、果發(fā)現一個新的與Stra8相互作用的蛋白-Setd8蛋白。Setd8是現今發(fā)現唯一能夠特異性單甲基化H4K20的賴氨酸甲基轉移酶，在許多生理過程中發(fā)揮著重要作用，但目前為止未見在生精細胞中的研究。本研究主要探討精子發(fā)生相關蛋白Stra8與Setd8的相互作用機制，為以后進一步研究Stra8與Setd8在精子發(fā)生中的作用機制提供理論基礎。
　　第一，利用雙熒光素酶報告基因實驗，明確Stra8與Setd8能夠相互轉錄調控。
　　

3、(一)Setd8對Stra8的轉錄調控分析。構建含有Stra8啟動子的重組質粒pGL3-Stra8Pro，與pRL-CMV共轉染到293T細胞中，檢測熒光素酶活性，確定Stra8啟動子有轉錄活性。然后用空載pCMV-HA、pCMV-HA-Setd8分別與pGL3-Stra8Pro共轉染至293T細胞，通過檢測熒光素酶活性，確定Setd8蛋白能夠抑制Stra8啟動子轉錄活性。此外，我們在上述系統(tǒng)中加入0、0.0625μg、0.125μg、

4、0.25μg和0.5μg不同含量的pCMV-HA-Setd8，結果發(fā)現，不同含量的Setd8蛋白對Stra8啟動子活性無顯著影響。
　?。ǘ㏒tra8對Setd8的轉錄調控分析。構建含有Setd8不同長度啟動子的重組質粒pGL3-Setd8Pro，分別與pRL-CMV共轉染到293T細胞中，檢測熒光素酶活性，確定Setd84種不同長度啟動子均有轉錄活性，其中在Setd8 mRNA上游-1499～+1bp的啟動子轉錄活性最強。因此

5、我們選擇pGL3-Setd8ProF2R用于后續(xù)實驗。然后用空載pCMV-Myc、pCMV-Myc-Stra8分別與pGL3-Setd8ProF2R共轉染至293T細胞，通過檢測熒光素酶活性，確定Stra8蛋白能夠增強Setd8啟動子轉錄活性。此外，我們在上述系統(tǒng)中加入0、0.0625tg、0.125μg、0.25μg和0.5μg不同含量的pCMV-Myc-Stra8。結果發(fā)現，當加入的蛋白量達到0.25μg時，能顯著增強Setd8啟動

6、子轉錄活性。
　　第二，Stra8與Setd8相互作用位點分析。
　?。ㄒ唬└鶕etd8含有的結構域，構建含有五種不同長短的Setd8截短片段的pGADT7重組質粒。將Setd8全長、五種截短片段和Setd8NO.50(81-286aa)分別與pGBKT7-Stra8片段共轉化至酵母菌株AH109中，并在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SD/-LTAH/X-α-gal中培養(yǎng)。結果顯示:Setd8全長以及構建的五個Setd8截短片段，均不能

7、與Stra8片段相互作用，而Setd8NO.50(81-286aa)與Stra8片段能夠相互作用。
　?。ǘ嫿⊿etd8F1R1（全長）及4種不同長短的Setd8截短片段的真核表達重組質粒。構建完成后瞬時轉染至293T細胞中驗證其表達。結果發(fā)現，這五種重組質粒蛋白都能正確表達。將構建的重組質粒、pCMV-HA-Setd8NO.50分別與pCMV-Myc-Stra8全長共轉染至293T細胞中，在293T細胞總蛋白中用鼠抗C-My

8、c進行免疫共沉淀，用兔抗HA進行Western Blot分析。結果表明，只有Setd8NO.50能夠與Stra8相互作用，其余的重組質粒都沒有相互作用。
　　第三，利用免疫共沉淀確定Setd8與Stra8相互作用的關鍵區(qū)域。
　　構建3種不同長短的Stra8截短片段的真核表達重組質粒。構建完成后瞬時轉染至293T細胞中驗證其表達。結果發(fā)現，這三種重組質粒只有一種能正確表達蛋白，其余兩種不表達蛋白。然后將能正確表達蛋白的質粒與

9、pCMV-HA-Setd8全長共轉染至293T細胞中，在293T細胞總蛋白中用鼠抗C-Myc進行免疫共沉淀，用兔抗HA進行Western Blot分析。結果表明，構建的Stra8截短片段與Setd8全長沒有相互作用。
　　第四，Stra8過表達對生精細胞的增殖和凋亡的影響。
　?。ㄒ唬├肧RB細胞增殖實驗研究Stra8穩(wěn)定過表達的精原細胞株Stra8-GC1與對照組Control-GC1在細胞增殖上是否有差異。根據細胞計數

10、使得起始細胞數相同，分別在鋪板后4h(day0)、day1、day2、day3、day4、day5時間點收集細胞，繪制生長曲線。由結果可知，每個對應時間點OD值均無統(tǒng)計學差異。說明Stra8對體外培養(yǎng)的精原細胞增殖無明顯影響。其次，我們利用流式細胞儀對上述細胞進行了細胞周期的檢測，結果表明，Stra8過表達對精原細胞細胞周期的影響無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，與SRB增殖實驗的結果相吻合。綜上結果說明Stra8對體外培養(yǎng)的精原細胞的分裂

11、增殖無明顯影響。
　?。ǘ㏒tra8過表達對生精細胞凋亡的影響。利用PI/AnnexinV雙標記檢測Stra8-GC1和Control-GC1在正常培養(yǎng)狀態(tài)下凋亡的發(fā)生率。結果發(fā)現，Stra8-GC1的早期凋亡率比Control-GC1的早期凋亡低，且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　第五，同步化Stra8過表達細胞，檢測細胞周期不同時期Stra8和Setd8 mRNA水平。
　　（一）經過實驗方法的優(yōu)化，最終用

12、無血清的DMEM培養(yǎng)Stra8-GC1細胞3天后，G0/G1期比例在60％以上;利用胸苷處理細胞20h后，S期比例能達到65％。利用諾考達唑處理8h后，將細胞阻滯在G2/M期。使用“拍打”的方法收集細胞。G2/M期比例達到90％以上，純度較高。
　?。ǘ?利用RT-PCR檢測上述同步化方法后的細胞周期不同時期Stra8和Setd8 mRNA水平。結果發(fā)現，在Stra8-GC1細胞中，Stra8和Setd8 mRNA水平在G0/G1

13、期最低，至S期逐漸升高，Setd8 mRNA水平在G2/M期保持不變，而Stra8有一定的下降。
　　通過上述研究，我們明確了Stra8和Setd8能夠相互進行轉錄調控。Stra8與Setd8蛋白能夠相互作用，但其相互作用機制有待進一步研究。Stra8對體外培養(yǎng)的生精細胞的增殖沒有明顯影響，而Stra8穩(wěn)定過表達的精原細胞早期凋亡率比對照組低。Stra8和Setd8mRNA水平在精原細胞不同的細胞周期時相中表達具有一定的規(guī)律性。這