人精子發(fā)生相關(guān)基因NYD-SP6的功能研究.pdf

1、正常的精子發(fā)生依賴于生精細(xì)胞的分裂分化和生精細(xì)胞凋亡之間的平衡，其背后是錯(cuò)綜復(fù)雜的基因-蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。尋找并掌握這些基因/蛋白的功能，將能更深入地闡明精子發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)理。 NYD-SP6是本實(shí)驗(yàn)室克隆出的一條編碼PHD蛋白的新基因，前期在mRNA水平對(duì)其進(jìn)行的一些初步研究已經(jīng)高度提示它是一條新的人精子發(fā)生相關(guān)基因。本研究中，我們對(duì)NYD-SP6基因在精子發(fā)生過(guò)程中的明確作用及其機(jī)制進(jìn)行了探討。 首先我們?cè)诘鞍姿綑z測(cè)

2、了NYD-SP6在人睪丸組織中的細(xì)胞定位。構(gòu)建了pET-22b-NYD-SP6(全長(zhǎng)ORF)原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到49KD原核表達(dá)蛋白。用純化的蛋白免疫BalB/C小鼠后獲得NYD-SP6多克隆抗體。進(jìn)一步進(jìn)行人睪丸組織免疫組化分析，顯示NYD-SP6蛋白在包括精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的各級(jí)生精細(xì)胞核中表達(dá)，提示NYD-SP6可能直接調(diào)控生精細(xì)胞的某種(些)生物學(xué)過(guò)程，影響精子發(fā)生。 進(jìn)一步我們以生精細(xì)胞為研究平臺(tái)

3、，檢測(cè)NYD-SP6在精子發(fā)生過(guò)程中的作用。由于NYD-SP6在小鼠中有高度同源的基因，因此我們?cè)谛∈缶?xì)胞系中超表達(dá)NYD-SP6，進(jìn)行了以下功能研究： ①應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了超表達(dá)組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示兩組在G0/G1期、S期及G2/M期的細(xì)胞比例均無(wú)顯著差異。提示NYD-SP6對(duì)生精細(xì)胞的分裂增殖無(wú)影響。 ②應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、DNAladder電泳、彗星實(shí)驗(yàn)三種方法檢測(cè)了超表達(dá)組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞分別

4、在自發(fā)情況和化學(xué)藥物Taxol誘導(dǎo)下的凋亡情況。結(jié)果顯示兩組細(xì)胞在自發(fā)情況下凋亡率均很低，組間無(wú)顯著差異；而在Taxol誘導(dǎo)下，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率顯著上升，而NYD-SP6超表達(dá)細(xì)胞凋亡率仍很低，兩組間差異顯著。提示NYD-SP6可能拮抗生精細(xì)胞的誘發(fā)性凋亡。 ③運(yùn)用基因芯片技術(shù)，對(duì)NYD-SP6超表達(dá)細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)Taxol誘導(dǎo)后，與未誘導(dǎo)細(xì)胞相比發(fā)生上調(diào)的基因進(jìn)行了篩選和比較。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Taxol誘導(dǎo)時(shí)NYD

5、-SP6超表達(dá)細(xì)胞中有一系列抗凋亡基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)抑制了部分促凋亡基因的上調(diào)。這些基因分別作用于p53、Bcl-2家族蛋白及caspase3和9，提示NYD-SP6可能參與拮抗生精細(xì)胞中線粒體凋亡途徑。最后我們還對(duì)NYD-SP6的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。通過(guò)將NYD-SP6與酵母Gal4蛋白的BD結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain)融合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果顯示NYD-SP6能激活下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。這一結(jié)果提示了NYD-SP6的轉(zhuǎn)錄