小鼠精子發(fā)生相關(guān)基因的克隆及分析.pdf

1、哺乳動物的精子發(fā)生是一個復(fù)雜的細(xì)胞分化過程，可分為有絲分裂期、減數(shù)分裂期和精子形成期三個階段。精原細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生初級精母細(xì)胞。初級精母細(xì)胞通過第一次減數(shù)分裂產(chǎn)生兩個次級精母細(xì)胞，次級精母細(xì)胞的間期很短，不發(fā)生DNA復(fù)制就進(jìn)入第二次減數(shù)分裂，形成單倍體的圓形精子細(xì)胞。圓形精子細(xì)胞通過一系列復(fù)雜的形態(tài)變化，發(fā)育為具有頭、頸、尾結(jié)構(gòu)的精子。精子發(fā)生過程受許多特異分子及細(xì)胞間作用的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，包括染色體結(jié)構(gòu)的變化及一系列特定基因的程序性表達(dá)

2、。這些內(nèi)在基因水平的變化又受許多外部因素如激素、環(huán)境因素及旁分泌細(xì)胞因子的影響。對調(diào)節(jié)精子發(fā)生過程中一系列特殊現(xiàn)象的分子機制所知甚少，尤其缺乏對關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的認(rèn)識。本研究試圖篩選出在精子發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用的基因或蛋白，并研究其功能，從而進(jìn)一步認(rèn)識精子發(fā)生的分子機理。論文主要包括以下主要內(nèi)容。 一．小鼠精子發(fā)生相關(guān)新基因(SRG-L)的全長克隆。在前期研究小鼠不同階段生精細(xì)胞基因表達(dá)譜的過程中，發(fā)現(xiàn)了一個在精子發(fā)生后期高表達(dá)的新

3、基因。隨后將該基因PCR產(chǎn)物純化、克隆、測序，發(fā)現(xiàn)該片段與GenBank中大鼠及猴的一個睪丸基因eDNA片段有很高的同源性，但均未見其相關(guān)功能的報道。根據(jù)已知的大鼠及猴的同源基因cDNA序列設(shè)計數(shù)對引物，利用重疊RT-PCR分別擴增出長度約為448bp、1122 bp、280bp、523bp和561bp的5個片段，經(jīng)序列測定后進(jìn)行拼接，得到2584 bp的cDNA片段。然后利用5'和3'cDNA末端快速擴增(Rapid Amplific

4、ation of cDNAEnds，RACE)技術(shù)，獲得該基因的5'及3'末端序列，由此完成了該基因全cDNA的測定，該基因為一新的小鼠基因，命名為SRG-L(spermatogenesis related gene expressedin the late stages of spermatogenic cells)，并在GenBank中注冊(接受號為AY352586)二．SRG-L表達(dá)特征分析。RT-PCR和Northern Blo

5、tting分析表明：該基因在早期A型和B型精原細(xì)胞中不表達(dá)，從雙線期初級精母細(xì)胞階段開始表達(dá)并逐漸上調(diào)，在粗線期初級精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞及長形精子細(xì)胞中均檢測到高水平的mRNA，但在成熟精子中消失，具有明顯的階段特異性表達(dá)特征，并且組織特異性表達(dá)分析顯示該基因在睪丸組織中的呈高表達(dá)。Western Blotting和免疫組織化學(xué)染色分析進(jìn)一步證實，SRG-L基因產(chǎn)物主要存在于雙線期/粗線期精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞及長形精子細(xì)胞中。因此初

6、步判斷這個基因在減數(shù)分裂早期被激活，轉(zhuǎn)錄在整個精子形成期維持較高水平的表達(dá)，有可能在精子發(fā)生后期起特殊作用，與減數(shù)分裂和精子變態(tài)成形相關(guān)。 三.SRG-L生物信息學(xué)分析。經(jīng)GenBank/Blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)檢索，證明這SRG-L序列為一個新的小鼠基因，全長cDNA為2843bp，包括2625bp完整的開放閱讀框架(open reading frame，ORF)，50bp-

7、2674bp為編碼區(qū)，編碼產(chǎn)生874個氨基酸的蛋白，分子量為104KD。翻譯起始密碼ATG上游-3位是A，下游+4位是G，構(gòu)成AGAATGG，屬于典型的“Kozak”序列。3′UTR 2831nt處有poly(A)尾，其上游29nt有典型的加尾信號(AATAAA)，無典型的啟動子序列，如CCAAT box或TATA box。同源分析顯示小鼠SRG-L與GenBank中大鼠、猴、人和狗等的同源基因無論在核酸水平還是編碼蛋白水平都具有較高的

8、同源性，表明該基因在進(jìn)化上的高度保守。經(jīng)Genebank/Blast分析，SRG-L定位在小鼠第八號染色體短臂33.1位點，跨越基因組29Kb，由18個外顯子和17個內(nèi)含子組成，外顯子和內(nèi)含子之間符合標(biāo)準(zhǔn)的ag/gt法則。生物信息學(xué)分析顯示在其N端184-270aa可能存在一跨膜區(qū)，預(yù)測該氨基酸序列為非分泌型蛋白，并且分別在Ser、Thr及Tyr存在多個潛在的磷酸化修飾位點和5個潛在的甲基化修飾位點。SRG-L不存在N端信號肽，線粒體定

9、位序列，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜滯留信號，RNA結(jié)合序列等。GenBank/NCBI Conserved Domain Search(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測SRG-L可能存在兩個保守的結(jié)構(gòu)域，分別是N端的(178-210aa)Transglutaminase/protease-like homologues domain和C端的(723-766aa)D-serine