斑馬魚intelectin基因zITLN1、zITLN2、zITLN3的克隆與功能研究.pdf

1、免疫系統(tǒng)最根本的作用是識(shí)別“自己”和“非己”，先天性免疫是免疫的第一道防線，先天性免疫系統(tǒng)對(duì)于“自己”和“非己”的識(shí)別主要是由一系列基因編碼受體來完成的，這些受體被稱為模式識(shí)別受體(PRRs)。病原分子共有的成分，比如細(xì)胞壁的多糖以及RNA病毒的雙鏈等，能夠被PRRs識(shí)別，并引發(fā)一系列的信號(hào)通路來對(duì)各種免疫相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)到清除病原體的效果。凝集素(Lectin)不僅能夠直接參與免疫防御，更是一種重要的模式識(shí)別分子，在先天

2、性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。
　　腸道凝集素(Intelectin，ITLN)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種能夠結(jié)合β-呋喃半乳糖的凝集素，在多種生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，并且與人類的很多疾病如哮喘、心臟病、腸炎、慢性阻塞性肺氣腫甚至癌癥都有一定關(guān)系。目前關(guān)于腸道凝集素的研究主要集中在哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、硬骨魚、文昌魚和海鞘當(dāng)中。雖然不同物種的ITLN序列高度保守，但是它們?cè)诒磉_(dá)模式和功能上也存在一定差異。鑒于ITLN在模式識(shí)別中的重要功能，研

3、究其模式識(shí)別的機(jī)制顯得尤為重要。斑馬魚作為一種重要的模式生物，具有較為完整的先天免疫和后天免疫系統(tǒng)，同時(shí)其免疫系統(tǒng)在分子和細(xì)胞水平上都與哺乳動(dòng)物相似度很高。所以我們選擇了斑馬魚的腸道凝集素(zebrafish Intelectin，zITLN)來研究其模式識(shí)別的機(jī)制。
　　我們首先利用生物信息學(xué)的技術(shù)手段，對(duì)斑馬魚Intelectin的進(jìn)化地位進(jìn)行分析，選擇了處于三個(gè)不同分支上的斑馬魚Intelectin:zITLN1、zITLN

4、2和zITLN3來進(jìn)行研究。我們對(duì)這3個(gè)zITLN進(jìn)行了克隆，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)的方法對(duì)成體斑馬魚的zITLN1、zITLN2和zITLN3的組織分布進(jìn)行了探索，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3個(gè)zITLN在腸道、眼球、皮膚、鰓、肝臟以及尾鰭中均有表達(dá)，但表達(dá)模式及表達(dá)量不盡相同:zITLN1和zITLN2主要集中在腸道中表達(dá)，肝臟中表達(dá)量很低，而zITLN3與前兩者不同，主要集中在肝臟中表達(dá)，當(dāng)然其在腸道中的表達(dá)量也相

5、對(duì)較高。我們同樣利用Real-time PCR的方法檢測了金黃色葡萄球菌對(duì)斑馬魚Intelectin表達(dá)的調(diào)控，結(jié)果表明金黃色葡萄球菌可以引起zITLN1、zITLN2和zITLN3的表達(dá)上調(diào)，但是程度與模式不盡相同:zITLN1和zITLN3對(duì)于金黃色葡萄球菌的刺激反應(yīng)更為靈敏，在注射金黃色葡萄球菌之后的4小時(shí)就出現(xiàn)了表達(dá)的上調(diào)，8小時(shí)達(dá)到最高值，而zITLN2在前8小時(shí)中的上調(diào)很緩慢，直到10小時(shí)突然達(dá)到峰值。我們利用大腸桿菌表達(dá)系

6、統(tǒng)對(duì)3種ITLN進(jìn)行了表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)中，熒光鏡檢顯示，鈣離子存在時(shí)，zITLN1、zITLN2和zITLN3重組蛋白均可以不同程度的引起FITC標(biāo)記的細(xì)菌的凝集，zITLN1和zITLN3一樣凝集金黃色葡萄球菌的能力要強(qiáng)于凝集大腸桿菌的能力，而zITLN2對(duì)于兩種細(xì)菌的凝集卻沒有表現(xiàn)出明顯差異。Western blotting結(jié)果顯示3個(gè)ITLN都可以結(jié)合細(xì)菌，zITLN1和zITLN3一樣結(jié)合金黃色葡萄球菌

7、的能力要強(qiáng)于結(jié)合大腸桿菌的能力，但是zITLN2對(duì)于兩種細(xì)菌的結(jié)合沒有表現(xiàn)出明顯差異。ELISA定量分析的結(jié)果表明zITLN1和zITLN3對(duì)PGN的親和性要高于LPS，而zITLN2在多糖結(jié)合上沒有明顯的偏向性?？偲饋碚f，zITLN2結(jié)合多糖的能力要高于zITLN1和zITLN3。上述結(jié)果表明:zITLN1、zITLN2和zITLN3可以識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，從而能結(jié)合細(xì)菌并引發(fā)細(xì)菌的凝集。但是它們的識(shí)別和結(jié)合效應(yīng)以及后續(xù)的作用機(jī)

8、制可能不同。為了進(jìn)一步探究intelectin基因內(nèi)在的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域，我們構(gòu)建了zITLN1-D5、zITLN2-D5和zITLN3-D5三個(gè)缺失突變體，通過細(xì)菌凝集、細(xì)菌結(jié)合和多糖結(jié)合的實(shí)驗(yàn)在斑馬魚當(dāng)中首次發(fā)現(xiàn)zITLN序列C末端100個(gè)左右的氨基酸(D5)在細(xì)菌凝集、細(xì)菌結(jié)合和糖結(jié)合方面的功能與其全長并無明顯差異。說明ITLN中負(fù)責(zé)多糖識(shí)別的是D5結(jié)構(gòu)域而并非此前有過報(bào)道的FReD結(jié)構(gòu)域。同時(shí)我們對(duì)D5結(jié)構(gòu)域中負(fù)責(zé)鈣離子結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)

9、行分析研究，通過細(xì)菌凝集、細(xì)菌結(jié)合和多糖結(jié)合的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了三個(gè)可能的與鈣離子結(jié)合相關(guān)的位點(diǎn)（G53-G54-G55）。我們進(jìn)一步將zITLN1和zITLN2的D5結(jié)構(gòu)域進(jìn)行互換，構(gòu)建了zITLN1-2D5和zITLN2-1 D5兩個(gè)嵌合體重組蛋白，對(duì)它們的凝集素功能進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)嵌合體重組蛋白的凝集素功能都是與其所包含的D5結(jié)構(gòu)域的功能相一致，進(jìn)一步說明D5是zITLN當(dāng)中重要的糖識(shí)別功能域，D5結(jié)構(gòu)域決定了全長的糖結(jié)合能力。

10、r>　　另外，我們利用ELISA技術(shù)檢測到zITLN1、zITLN2和zITLN3重組蛋白都可以與小牛乳鐵蛋白進(jìn)行結(jié)合，但是zITLN1、zITLN2和zITLN3重組蛋白并不具備殺菌功能。
　　以上對(duì)斑馬魚3個(gè)ITLN結(jié)合多糖從而結(jié)合細(xì)菌、凝集細(xì)菌的研究能夠加深我們對(duì)ITLN基因參與細(xì)菌感染引起的免疫防御機(jī)制的理解，而對(duì)于糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的研究初步探索了斑馬魚腸道凝集素糖識(shí)別的機(jī)制，為intelectin基因在其他病理和生理過程中的