斑馬魚Somatostatin-3基因敲降胚胎的營救及功能驗(yàn)證.pdf

1、生長抑素(Somatostatin，SS)是具有多種生物學(xué)活性的環(huán)肽激素家族，主要分布在內(nèi)分泌胰腺、消化道，周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在頜下腺、甲狀腺、腎上腺、腎臟、前列腺、血管壁、胎盤和免疫細(xì)胞中也有少量分布。細(xì)胞研究表明，生長抑素通過與G蛋白偶聯(lián)的受體結(jié)合發(fā)揮其生理學(xué)作用，抑制生長激素分泌和釋放，抑制內(nèi)分泌激素和胃腸道外分泌的作用，能作為神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，能調(diào)節(jié)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖和分化。目前，在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)存在6種SS

2、基因（SS1-6），但對SS在胚胎中的功能知之甚少。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)SS3在斑馬魚胰腺組織中持續(xù)表達(dá);雙敲降SS3和SS4，胰高血糖素和胰島素mRNA顯著減少。為驗(yàn)證SS3在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中對胰島素的調(diào)控表達(dá)，我們選用斑馬魚的胚胎為模型，利用體外合成SS3mRNA對敲降胚胎進(jìn)行營救實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果對了解SS3在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的功能具有重要意義。
　　 首先，為驗(yàn)證MO的有效性，構(gòu)建了包含SS35’端MOs靶序列帶報(bào)

3、告基因EGFP的pCS2+SS3MOEGFP重組質(zhì)粒，通過在斑馬魚胚胎中共注射SS3MOs和pCS2+SS3MOEGFP重組質(zhì)粒，結(jié)果表明基于SS3mRNA所設(shè)計(jì)的SS3靶向反義寡核苷酸MOs在活體胚胎細(xì)胞中可以高效和特異性的敲降SS3基因表達(dá)，具有很強(qiáng)的靶向序列特異性。其次，基于密碼子簡并性，通過亞克隆引入突變堿基，但保持編碼氨基酸不變，構(gòu)建了抗-SS3MO帶報(bào)告基因的融合質(zhì)粒，共注射SS3MOs和pCS2+SS3EGFP重組質(zhì)粒，結(jié)

4、果表明質(zhì)粒在胚胎細(xì)胞中成功表達(dá)報(bào)告基因，并證明了該突變序列具有MO抗性。
　　 利用“功能獲得”的方法用抗-SS3MO的pCS2+SS3kzm重組質(zhì)粒體外合成SS3mRNA并與MOs共注射進(jìn)行營救實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示共注射SS3MOs+SS4MOs+抗-SS3MOmRNA的斑馬魚胚胎表型和對照組無顯著差異，表明體外合成的SS3mRNA可以營救SS3MOs和SS4MOs表型缺陷。體外轉(zhuǎn)錄的抗-SS3MOmRNA在體內(nèi)所合成的蛋白質(zhì)能夠替

5、代體內(nèi)天然SS3的大部分功能。
　　 為了驗(yàn)證馬魚胚胎SS3對胰島素基因表達(dá)調(diào)節(jié)的特異性，我們用地高辛標(biāo)記的核酸探針原位雜交檢測胰島素mRNA的表達(dá)分析營救效果，結(jié)果表明:雙敲降SS3和SS4后，胰島素mRNA顯著減少，注射SS3mRNA營救雙敲降胚胎使胰腺細(xì)胞胰島素mRNA表達(dá)恢復(fù)或增加。推測SS3在斑馬魚胚胎發(fā)育時期可能以旁分泌的形式通過一定的途徑參與斑馬魚胚胎胰腺細(xì)胞胰島素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，SS3能夠替代SS4對胰島素的調(diào)節(jié)