斑馬魚中siRNA介導的RNA干擾及DEC1-Sharp2-Stral3基因的克隆和功能研究.pdf

1、RNA干擾是指通過導入一段與內(nèi)源基因同源的雙鏈RNA序列(dsRNA)，使內(nèi)源mRNA降解，從而導致轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。RNA干擾廣泛存在于細菌、植物和動物中。脊椎動物中，長鏈dsRNA能引發(fā)干擾素反應(yīng)而引起非特異性的mRNA降解，而21—23nt長度的siRNA能特異性介導基因的沉默，因而被廣泛應(yīng)用于基因功能研究。目前斑馬魚siRNA干擾方面的報道極少。本文中，我們開展了U6啟動子驅(qū)動的siRNA介導的斑馬魚RNA干擾研究。選擇功能明確

2、且與表型相關(guān)的4個斑馬魚內(nèi)源基因MyfS,Dlg3,Mitfa(Nacre)和Mitfb和GFP報告基因為靶基因，分別選2—4個靶位點，構(gòu)建U6啟動子驅(qū)動的siRNA表達載體，顯微注射至斑馬魚受精卵，追蹤觀察胚胎發(fā)育。根據(jù)表型分析結(jié)合整胚原位雜交結(jié)果，探測siRNA對斑馬魚體內(nèi)基因表達的影響。結(jié)果表明：1．)U6啟動子驅(qū)動的siRNA能抑制斑馬魚靶基因的表達，但抑制作用不完全。2．)在所選的靶位點中，siGFP對斑馬魚體內(nèi)的GFP表達無

3、明顯的抑制作用；3．)針對不同的靶位點，siRNA介導的干擾效果有差異。斑馬魚中siRNA介導的RNA干擾是否存在非特異性，有待進一步探索。 DECl／Sharp2／Stral3是bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在哺乳動物的胚胎發(fā)育，細胞分化，增殖和凋亡過程中起重要的調(diào)控作用。DECl參與哺乳類生物鐘的調(diào)控，是哺乳類的第5類生物鐘基因。本文克隆了斑馬魚的DECl基因，進行了生物信息學分析，檢測了LD周期下斑馬魚胚胎發(fā)育階段DECl的表

4、達和成體眼中的DECl表達。同時進行了DECl的過表達和DECl．MO反義抑制研究。結(jié)果如下：1．)斑馬魚DECl基因的全長2743bp，編碼403個氨基酸的蛋白質(zhì)。BLAST分析表明，斑馬魚的DECl與Tetraodon(CAAE01014528．1)，鼠0,~011498．2)，人(NM003670．1)，Xenopus(BC073563．1)和Canis(AY204568．1)的同源蛋白分別具有64％、60％、59％、46％和39

5、％的相似性。斑馬魚DECl含有與人和鼠DECl極其相似的保守結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子DECl的家族成員。2．)斑馬魚胚胎發(fā)育早期直到4體節(jié)期，DECl普遍且強烈表達，隨著發(fā)育的進行，DECl在眼，體節(jié)，血島和松果體等多種組織中表達；至Pet-finstag(60hpf)，體節(jié)等組織中的DECl表達減弱，至Protruding-mouthstage(72hpf)，DECl的表達僅局限在松果體和視網(wǎng)膜色素上皮中。DECl在斑馬魚成體眼中