外源dsRNA-siRNA介導的玉米粘蟲RNA干擾機制的研究.pdf

1、RNA干擾是一種廣泛存在于真核生物細胞內的轉錄后水平的基因沉默機制。該機制由內源性或外源性長鏈dsRNA介導，被RNaseⅢ家族核酸內切酶Dicer切割成21-25nt長度的雙鏈siRNA后，與Argonaute蛋白和Dicer酶復合形成RNA誘導的沉默復合體(RISC)，在RISC的引導下，雙鏈siRNA中的反義鏈與相應靶標mRNA特異性結合，在核酸內切酶的作用下使靶標mRNA降解從而引起基因沉默。
　　本研究使用鱗翅目夜蛾科昆

2、蟲玉米粘蟲（Mythimna separata）作為研究材料，選擇高表達且影響玉米粘蟲生長發(fā)育的關鍵基因β-actin作為RNA干擾的靶標基因，以喂飼法將dsRNA以及siRNA導入昆蟲體內，通過小RNA測序的方法，研究RNA干擾效應所產(chǎn)生的siRNA的結構和豐度等，檢測到了長度為18-35nt的小RNA。對測序數(shù)據(jù)進行整理以及reference mapping、small RNA coverage和lengthdistribution

3、等生物信息學分析后發(fā)現(xiàn):(1)在靶標基因的正鏈和負鏈都出現(xiàn)了不同程度的小RNA富集情況且存在若干明顯的小RNA高豐度熱點區(qū)域;(2)在負鏈上檢測到的小RNA富集僅出現(xiàn)在dsRNA導入?yún)^(qū);(3)在正鏈上導入?yún)^(qū)和導入?yún)^(qū)之外均檢測到了小RNA的存在，由于玉米粘蟲體內并未發(fā)現(xiàn)RdRp及其同源基因，這可能歸結于其它與RdRp具有相似功能的內源性聚合酶，使siRNA誘導的mRNA降解效應擴展至導入?yún)^(qū)之外，使非導入?yún)^(qū)mRNA降解成短片段并產(chǎn)生正鏈上的

4、熱點區(qū)富集。為驗證小RNA測序分析結果，我們進行了Northern雜交檢測并證實了熱點區(qū)富集現(xiàn)象的存在，且具有鏈特異性。另外，通過qPCR實驗檢測到了RNA干擾效應對β-actin基因的表達抑制現(xiàn)象，而且其結果與小RNA測序得到的靶位點切割結果相吻合。
　　目前，利用RNA干擾技術對昆蟲的內源基因進行干擾抑制的實驗多有報道。而且RNA干擾介導的轉基因抗蟲植物的培育是昆蟲生物防治的一個新的研究課題，但是對昆蟲RNA干擾機制，尤其其中