應(yīng)用RNA干擾技術(shù)研究Neuritin對Neuralized介導(dǎo)的Notch信號途徑的影響.pdf

1、目的：觀察Neuritin表達降低對Neuralized介導(dǎo)的Notch信號途徑的影響，探討Neuritin在神經(jīng)再生及神經(jīng)系統(tǒng)可塑性中的作用機制。
　　 方法：
　　 （1）Neuritin高表達細胞株的篩選：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測293T細胞及L-02細胞中neuritin基因的表達水平。
　　 （2）PBS/U6-neuritin siRNA（1-3）表達載體的構(gòu)建：應(yīng)用基因工程的方法以PBS/U6為空載

2、體，通過兩步法構(gòu)建PBS/U6-neuritin siRNA干擾質(zhì)粒。
　　 （3）PBS/U6-neuritin siRNA干擾質(zhì)粒的鑒定：PBS/U6-neuritin siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Neuritin高表達細胞株，Western-blot檢測細胞中Neuritin的表達，鑒定干擾載體的干擾效率。
　　 （4）Neuritin siRNA對Notch信號途徑配體Jaddeg1蛋白表達水平的影響：利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法

3、共轉(zhuǎn)染pIRES-HA-JAG1與PBS/U6-neuritin siRNA-（1-3）與293T細胞中，Western-blot檢測Neuritin蛋白表達降低時，Jaddeg1蛋白的表達水平。
　　 （5）Neuritin siRNA對Jaddge1蛋白內(nèi)吞的影響：利用細胞內(nèi)熒光定位技術(shù)觀察細胞內(nèi)Neuritin蛋白表達降低時，Jaddge1蛋白的內(nèi)吞情況。
　　 結(jié)果：
　　 （1）RT-PCR結(jié)果顯示：N

4、euritin蛋白在293T細胞及L-02細胞中高表達，選擇293T細胞為實驗細胞株。
　　 （2）載體構(gòu)建及干擾效率鑒定結(jié)果：PBS/U6-neuritin siRNA1-3載體經(jīng)測序鑒定后,Western-blot結(jié)果顯示neuritin干擾質(zhì)?？墒?93T細胞內(nèi)源性Neuritin表達降低。
　　 （3）Neuritin siRNA對Jaddeg1蛋白表達水平的影響：Western-blot結(jié)果顯示，阻斷Neuri

5、tin的表達，細胞中Jaddeg1蛋白表達水平下調(diào)。
　　 （4）Neuritin siRNA對Jaddge1蛋白內(nèi)吞的影響：Neuritin蛋白表達降低引起Jaddeg1蛋白內(nèi)吞增加。
　　 結(jié)論：
　　 （1）Neuritin蛋白表達降低可以導(dǎo)致Notch信號途徑配體Jaddeg1蛋白的表達下調(diào)。
　　 （2）Neuritin蛋白表達下調(diào)可使Jaddeg1蛋白的內(nèi)吞增加。
　　 綜上所述：Ne