RNA干擾逆轉(zhuǎn)GCS介導的乳腺癌多藥耐藥的體內(nèi)外研究.pdf

1、背景：多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤對未接觸過的、結(jié)構(gòu)不同、靶位各異的多種抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性。它是惡性腫瘤化療治療失敗的主要原因。MDR產(chǎn)生的機制常同時存在，但以一種為主，且不同機制間常相互影響。近年來，葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶(glucosylceramide synthase，GCS)介導的凋亡調(diào)控與MDR方面的研究引起了人們的關(guān)注。 GCS催化LJDP-glucose上的糖基與神

2、經(jīng)酰胺相結(jié)合，使細胞逃避神經(jīng)酰胺介導的促凋亡作用，對MDR的產(chǎn)生具有重要作用。神經(jīng)酰胺，是由細胞膜神經(jīng)鞘磷脂水解產(chǎn)生的一種脂質(zhì)分子，是介導細胞凋亡的第二信使，參與了腫瘤細胞對于化療和放療的反應。神經(jīng)酰胺的缺失是導致細胞對。TNF-αQ，離子射線和阿霉素誘導的凋亡抵抗的一個原因。GCS糖基化產(chǎn)物葡萄糖神經(jīng)酰胺(Glucossylceramide，GlcCer)在耐藥腫瘤細胞表達水平明顯升高，抑制神經(jīng)酰胺的糖基化可以逆轉(zhuǎn)對化療藥物的耐藥性。

3、許多化療藥物可以抑制GCS的活性并增加細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的合成。如PPPP(1-phenyl-2-hexadecanoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol)，PDMP(1-phenyl-2-dsdecanoylamino-3-morpholino-l-propanol)和cyclosporin A。但在臨床實驗中這些藥物特異性不高，且具有毒副作用，限制了其進一步應用。因而開發(fā)低毒、高效的MDR逆轉(zhuǎn)劑成為臨床治療的

4、需要。以往的研究中，反義寡核苷酸(ASODN)、核酶均已顯示出逆轉(zhuǎn)MDR的效果。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種新興的有效的分析基因功能的工具。通過導入細胞雙鏈RNA(dsRNA)而導致序列特異性的基因沉默。RNAi是由dsRNA引起的，dsRNA可以被一種具有RNaseIII樣活性的dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶(dsRNA specific endonuclease，Dicer)作用下被切割成2

5、1～23 bp的RNA片段，即小干擾RNA(siRNA)。siRNA接著與RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)結(jié)合，序列特異性的識別和切割目的mRNA。此外，短發(fā)夾狀RNA(shRNA)在結(jié)構(gòu)上與siRNA相似，也能夠引發(fā)RNAi的效應。與siRNA相比，shRNA比合成的siRNA表達更持久。 目的： 利用載體pSUPER構(gòu)建靶向GCS的短發(fā)夾狀RNA(Sli

6、lall hairpin RNA，shRNA)，脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染人耐藥乳腺癌細胞MCF-7/ADR，觀察其對人耐藥乳腺癌細胞GCS基因和mdrl基因表達的抑制作用，探討其對乳腺癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用和機制；通過pSIJPER．retro逆轉(zhuǎn)錄表達載體構(gòu)建靶向GCS基因的重組載體，建立穩(wěn)定表達靶向GCS重組載體的乳腺癌細胞，研究其對乳腺癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用和作用機制，探索提高乳腺癌化療效果的新途徑：穩(wěn)定表達靶向GCS重組載體的乳腺癌細胞導入裸

7、鼠體內(nèi)，觀察其對于裸鼠腫瘤生長的抑制作用及耐藥相關(guān)基因GCS和mdrl的影響，探討穩(wěn)定表達的重組載體在體內(nèi)水平對乳腺癌的抑瘤效應和耐藥逆轉(zhuǎn)效果。為乳腺癌的耐藥逆轉(zhuǎn)治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 方法： 1．設(shè)計合成兩對葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶(glLmosylceramidesynthase，GCS)基因編碼的反向重復序列，中間間隔6個nt，體外合成并定向克隆入真核表達載體psiJPER，構(gòu)建pshRNA-GCSl和pshR

8、NA-GCS2重組質(zhì)粒。體外瞬時轉(zhuǎn)染人耐藥乳腺癌細胞MCF-7/ADR，逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)、Western blot和免疫細胞化學方法測定重組質(zhì)粒對GCS表達的影響。RT-PCR、Western blot檢測重組質(zhì)粒對mdrlmRNA及其表達產(chǎn)物P-gp的影響。羅丹明123外排試驗測定P-gp轉(zhuǎn)運功能的變化。Western b1ot、比色法檢測細胞內(nèi)caspase-3的表達，流式細胞儀分析細胞凋亡率的改變。四氮唑鹽(M

9、TT)法檢測阿霉素、長春新堿和柔紅霉素對耐藥乳腺癌細胞的半數(shù)細胞抑制濃度(IC<,50>)。 2．體外合成2對GCS基因的特異性siRNA，克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pStJPER.retro，轉(zhuǎn)染包裝細胞PA137，收集含病毒顆粒的培養(yǎng)上清感染MCF-7/ADR細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選并擴大培養(yǎng)后得到克隆，繼續(xù)培養(yǎng)2個月形成穩(wěn)定克隆MA/PSR1和MA/PSR2。RT-PCR、Western blot法檢測 MA/PSRl和MA/PS

10、R2細胞內(nèi)GCS及受其調(diào)控的基因mdrl的表達；羅丹明123外排試驗測定P-gp的功能。Westerll blot、比色法檢測細胞內(nèi)caspase-3的表達，四氮唑鹽(MTT)比色法檢測阿霉素、長春新堿等化療藥物對耐藥乳腺癌細胞的半數(shù)細胞抑制濃度(IC<,50>)。 3．穩(wěn)定表達靶向GCS重組載體的乳腺癌細胞MA/PSRl和MA/PSR2以注射的方法導入裸鼠體內(nèi)，并以空載體細胞MA/CON作為對照，觀察不同細胞組裸鼠腫瘤的生長

11、情況，繪制腫瘤生長曲線，測量不同組裸鼠腫瘤體積和重量。提取腫瘤組織RNA和蛋白，RT—PCR測定GCS及mdrlmRNA水平的表達；免疫印跡法測定二者蛋白水平的表達。探討穩(wěn)定表達的重組載體在體內(nèi)水平介導的抑瘤效應及對腫瘤多藥耐藥的影響。 結(jié)果： 1．雙酶切鑒定重組載體后，DNA測序證實成功構(gòu)建了針對GCS的表達載體pshRNA—GCSl和pshRNA—GCS2。兩對重組質(zhì)粒均可特異性抑制GCS基因表達，轉(zhuǎn)染后GCSmRN

12、A抑制率分別為86％、88％，GCS蛋白含量分別下降80％、82％，GCS表達陽性率降低為18.1％、16.7％。RT—PCR檢測mdrlmRNA的表達水平分別降低了79％和82％，Western blot分析P-gp表達水平分別下降了73％和77％，羅丹明123外排試驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后胞羅丹明123的熒光強度分別由23.7％增加至55.1％、57.5％。Western blot、比色法顯示轉(zhuǎn)染后caspase一3表達和活性均顯著增強，M

13、TT法結(jié)果顯示耐藥乳腺癌細胞對阿霉素、長春新堿等化療藥物的耐藥性有明顯下降。流式細胞儀結(jié)果表明細胞凋亡率明顯增加。而空載體對照組無以上作用。 2．建立了穩(wěn)定表達PSR—GCS-i和PSR—GCS-2及空載體的細胞株MA／PSRl、MA／PSR2和MA／CON。MA／PSRl和MA／PSR2細胞其GCS mRNA表達分別降低了89％和92％，Western blot分析GCS蛋白表達分別降低了83％和87％。MA／CON組細胞G

14、CS基因表達水平無明顯改變。MR／PSRl和MA／PSR2細胞mdrlmRNA的水平分別下降了85％和89％，P—gP水平分別下降了81％和83％，而MA／CON細胞mdrlmRNA和P-gp的水平無明顯變化。羅丹明123外排實驗結(jié)果顯示，MA／PSRl和MA／PSR2細胞羅丹明123的熒光強度分別由23.7％增加至61.3％、63.9％，與MA／CON細胞相比差異有顯著性(P

15、se-3的表達和活性顯著提高，對阿霉素、長春新堿、柔紅霉素多種化療藥物的敏感性增加。 3．MA／PSRl和MA／PSR2組裸鼠腫瘤生長受到明顯抑制，腫瘤生長速度延遲，與空載體細胞MA／CON組裸鼠腫瘤相比有顯著性差異(P(0.01)。與MA／CON組比較，MA／PSRl和MA／PSR2組裸鼠腫瘤體積抑制率分別為90.4％和92.2％，腫瘤重量抑制率為90.4％和92.6％。RT—PCR檢測發(fā)現(xiàn)MA／PSRl和MA／PSR2組裸

16、鼠腫瘤組織內(nèi)GCS和mdrlmRNA的表達明顯減弱，Western blot分析結(jié)果表明GCS蛋白和P—gp表達水平亦有明顯降低，與空載體組差異具有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論： 1．靶向GCS的shRNA重組質(zhì)粒psHRNA—GCS1和pstlRNA—GCS2可有效抑制人耐藥乳腺癌細胞中GCS基因表達，并降低了mdrlmRNA和蛋白水平的表達，明顯抑制了P—gp的轉(zhuǎn)運功能。 2．與重組質(zhì)粒psHhRNA—G

17、CSl和pshRNA—GCS2轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞比較，穩(wěn)定表達重組載體PSR—GCS—l和PSR—GCS-2的乳腺癌細胞MA／PSRl和MA／PSR2其GCSmRNA和GCS蛋白的表達水平較低，對于mdrlmRNA和P—gp蛋白表達的抑制效果更明顯；且更有效的抑制了P—gp的功能。提示mdrl基因的抑制效果與GCS基因的抑制效果呈正相關(guān)，穩(wěn)定表達重組載體的細胞對于靶基因及mdrl基因的沉默效果比瞬時轉(zhuǎn)染的效果好。 3．穩(wěn)定表達的重