應(yīng)用反義缺氧誘導(dǎo)因子-1α逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥的研究.pdf

1、研究背景：腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的產(chǎn)生是腫瘤化療中經(jīng)常遇到的現(xiàn)象，也是導(dǎo)致其化療失敗，腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要原因。原發(fā)性乳腺癌對(duì)化療比較敏感，大多數(shù)初治患者應(yīng)用結(jié)構(gòu)和機(jī)制不同的各類細(xì)胞毒性藥物獲得緩解，但往往緩解率高，緩解期短，并且絕大多數(shù)產(chǎn)生了MDR。MDR的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，其中mdrl基因及其表達(dá)產(chǎn)物P-糖蛋白的過表達(dá)是最主要的原因?，F(xiàn)已證實(shí)具有外排功能的P-gp在多種耐藥的細(xì)胞系中高表達(dá)。

2、現(xiàn)在關(guān)于P-gp在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的機(jī)制并不十分清楚，因此MDR的產(chǎn)生機(jī)制和逆轉(zhuǎn)方法的研究成為腫瘤研究的重點(diǎn)。除mdrl基因過表達(dá)這一主要因素外，腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的改變與腫瘤多藥耐藥的關(guān)系成為MDR機(jī)制和逆轉(zhuǎn)研究的新熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞微環(huán)境改變中最重要的是細(xì)胞的缺血缺氧，由于缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia inducible factor 1，HIF-1)在細(xì)胞缺氧改變中占有重要中心地位，因此HIF-l與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的關(guān)系備受關(guān)注。

3、 惡性腫瘤組織的一個(gè)顯著特點(diǎn)就是快速增殖性。在腫瘤生長(zhǎng)過程中，由于腫瘤細(xì)胞增生迅速，造成腫瘤微環(huán)境始終處于相對(duì)缺氧狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)表明，幾乎所有的實(shí)體瘤中均有缺氧細(xì)胞存在，其數(shù)量與腫瘤的組織學(xué)類型及增長(zhǎng)速度有關(guān)，通常其比例隨腫瘤體積增加而增加。缺氧可觸發(fā)腫瘤產(chǎn)生一系列應(yīng)激性保護(hù)反應(yīng)，使得腫瘤細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下免受損傷或死亡。有研究表明腫瘤細(xì)胞中存在的缺氧誘導(dǎo)因子-1在腫瘤缺氧環(huán)境中起著中樞紐帶作用。HIF-1是一個(gè)由HIF-1α和HIF-1

4、β亞單位構(gòu)成的異二聚體，其中HIF-1中亞單位HIF-1α對(duì)氧的依賴性較強(qiáng)，當(dāng)周圍環(huán)境的氧濃度下降時(shí)，HIF-1α表達(dá)增加，并且其表達(dá)增加表現(xiàn)在多個(gè)水平上，包括轉(zhuǎn)錄和蛋白等水平，但主要是蛋白水平明顯增多。亞單位HIF-1β對(duì)氧的依賴性較弱，但在HIF-1中也必不可少，因?yàn)橹挥性趦蓚€(gè)亞單位聚合并且發(fā)生適形性變化后，與其要調(diào)節(jié)的下游因子或酶的低氧反應(yīng)性元件( hypoxicresponsive element，HRE)結(jié)合，才能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用

5、。HIF-1α在人類多種腫瘤組織中高表達(dá)，甚至在癌前病變和某些增生性疾病中出現(xiàn)，同時(shí)有研究表明實(shí)體腫瘤和轉(zhuǎn)移灶中無血管區(qū)的腫瘤細(xì)胞由于缺氧導(dǎo)致對(duì)抗腫瘤藥物的抵抗。 傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)MDR的藥物由于逆轉(zhuǎn)劑量對(duì)人體的副作用極大而在臨床應(yīng)用中受到限制，新型多藥耐藥產(chǎn)生機(jī)制和有效逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn)的研究成為極具價(jià)值的攻克腫瘤和多藥耐藥的關(guān)鍵，因此尋找新的針對(duì)乳腺癌多藥耐藥的目的基因是亟待研究的課題。對(duì)HIF-lα與乳腺癌多藥耐藥關(guān)系的研究有助于發(fā)現(xiàn)耐藥產(chǎn)

6、生的新機(jī)制，并為治療乳腺癌和多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)提供新的作用靶點(diǎn)和治療途徑。 研究目的：研究缺氧誘導(dǎo)因子—1α在腋淋巴結(jié)陰性乳腺癌組織中的表達(dá)及其與P-糖蛋白表達(dá)的相關(guān)性；檢測(cè)有氧和缺氧條件下缺氧誘導(dǎo)因子—1α在乳腺癌敏感細(xì)胞MCF-7和多藥耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中的表達(dá)情況及其與MDR的關(guān)系；利用HIF-1α基因片段構(gòu)建其反義真核表達(dá)載體并通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染到體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞中，觀察對(duì)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)、周期阻滯效應(yīng)和耐藥逆轉(zhuǎn)作用

7、；在體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞中聯(lián)合過表達(dá)抑癌基因PTEN和反義HIF-1α，觀察PTEN對(duì)反義HIF-1α逆轉(zhuǎn)乳腺癌MDR的協(xié)同作用，為乳腺癌的靶向性基因治療和耐藥逆轉(zhuǎn)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法： 1．采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)81例腋淋巴結(jié)陰性乳腺癌(Axillary Node-Negative Breast Carcinoma，ANNBC)和相應(yīng)癌旁組織中HIF-lα、P-gp的表達(dá)狀況，并對(duì)患者進(jìn)行5年隨訪，分析兩者的

8、表達(dá)與各臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系。 2．乳腺癌MCF-7細(xì)胞和耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR分別置于有氧和缺氧條件下培養(yǎng)，采用RT-PCR方法檢測(cè)中HIF-1α、mdrl mRNA變化，并探討兩者的時(shí)效關(guān)系；Western blotting觀察HIF-1α、P-gp蛋白水平的變化；MTT、Rhl23外排實(shí)驗(yàn)觀察P-gp功能的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和周期的改變。 3．利用HIF-1α基因片段構(gòu)建其反義真核表達(dá)載體并初步

9、觀察其體內(nèi)外逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥性的作用。 4．體內(nèi)外聯(lián)合應(yīng)用過表達(dá)抑癌基因PTEN和反義HIF-1α觀察PTEN對(duì)反義HIF-1α逆轉(zhuǎn)乳腺癌MDR的協(xié)同作用。 結(jié)果： 1．HIF-1α在乳腺癌中總陽(yáng)性表達(dá)率為69.1％，其中強(qiáng)表達(dá)10例(12.3％)，中度表達(dá)12例(14.8％)，弱表達(dá)34例(42.0％)，陰性25例(30.9％)；81例乳腺癌組織中34例P—gp表達(dá)陽(yáng)性，占42.0％，其中強(qiáng)表達(dá)7例

10、(8.64％)，中度表達(dá)9例(11.1％)，弱表達(dá)18例(22.2％)，陰性47例(58.0％)；HIF—lα和P—gp在乳腺癌中兩者陽(yáng)性指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.62，p<0.01)；HIF一1α陽(yáng)性為單獨(dú)影響乳腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素。 2．缺氧lh時(shí)MCF一7細(xì)胞的HIF—lα mRNA已有表達(dá)，在缺氧3h時(shí)達(dá)到最高(5．4倍)；缺氧1h時(shí)MCF一7/ADR細(xì)胞的HIF一1α mRNA有表達(dá)，在缺氧3h時(shí)達(dá)到最高(5.9倍)。缺氧時(shí)M

11、CF一7細(xì)胞中開始出現(xiàn)mdrl mRNA的表達(dá)并在缺氧12h時(shí)達(dá)到最高(5.7倍)；缺氧條件下MCF一7/ADR細(xì)胞中mdrl mRNA的表達(dá)也增強(qiáng)(缺氧1h為1.4倍，缺氧12小時(shí)為2.3倍)。統(tǒng)計(jì)顯示，有氧和缺氧條件下細(xì)胞中HIF—lα、mdrl mRNA的表達(dá)均有顯著性差異(p<0.05)。相關(guān)分析顯示缺氧條件下MCF一7、MCF一7/ADR細(xì)胞中HIF一lα、mdrl基因的mRNA表達(dá)為正相關(guān)(r<,S>=1.258，p<0.0

12、l，r<,S>=0.416，p<0.05)。細(xì)胞缺氧12h時(shí)HIF一1α蛋白的表達(dá)最高，缺氧24h時(shí)表達(dá)不再升高。缺氧條件下MCF一7細(xì)胞中開始出現(xiàn)P—gp的表達(dá)，在24h表達(dá)最高并且不再增加；MCF一7/ADR細(xì)胞缺氧條件下P—gp表達(dá)也明顯增加。MTT法和Rhl23外排實(shí)驗(yàn)表明缺氧條件下細(xì)胞的P—gp功能增強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示缺氧條件下細(xì)胞發(fā)生周期阻滯、凋亡率降低。 3。酶切電泳和測(cè)序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了針對(duì)HIF一lα的反

13、義真核表達(dá)載體。脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)2組細(xì)胞中HIF一1α、mdr一1mRNA、蛋白顯著降低(p<0.05)；細(xì)胞TCL測(cè)定MCF一7細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞TCL改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；MCF一7/ADR實(shí)驗(yàn)2組TCL與對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組之間均有顯著性差異(P<0.05)；Rhl23外排實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)2組中的兩種細(xì)胞外排能力顯著增強(qiáng)；流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)實(shí)驗(yàn)2組較對(duì)照組凋亡率升高，S期細(xì)胞數(shù)目增加。動(dòng)物移植瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)asHIF一la

14、可抑制腫瘤生長(zhǎng)，免疫組化、Western blotting顯示實(shí)驗(yàn)2組移植瘤中HIF—la p—gp表達(dá)低于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1組。 4．聯(lián)合轉(zhuǎn)染抑癌基因PTEN和反義HIF—lα，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)4組細(xì)胞中HIF一lα、mdr—lmRNA、蛋白顯著降低(p<0.01)，實(shí)驗(yàn)4組細(xì)胞中HIF—lα、mdrl mRNA、蛋白較實(shí)驗(yàn)2、3組也有顯著降低(p<0.05)；MTT、法檢測(cè)TCL結(jié)果顯示，MCF一7細(xì)胞轉(zhuǎn)染asHIF或PTEN后

15、細(xì)胞TCL改變與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，但細(xì)胞TCL有減少的趨勢(shì)；實(shí)驗(yàn)4組TCL改變與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。MCF-7/ADR實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)4組TCI與對(duì)照組之間均有顯著性差異(p<0.05)，實(shí)驗(yàn)4組與實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；羅丹明(Rhl23)外排實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)4組較對(duì)照組外排能力均增強(qiáng)(

16、p<0.05)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)4組與實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組比較外排能力均增強(qiáng)(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)4組比較對(duì)照組S期細(xì)胞比例增多，細(xì)胞凋亡率升高(p<0.05)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)4組與實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組比較S期細(xì)胞比例增多，細(xì)胞凋亡率也增強(qiáng)(p<0.05)。 結(jié)論：1．缺氧誘導(dǎo)因子1α可作為判斷ANNBC預(yù)后的單獨(dú)指標(biāo)，檢測(cè)HIF-1α的表達(dá)有助于臨床上更準(zhǔn)確地評(píng)估ANNBC生存率；在ANNBC中HIF-1α表達(dá)與P-gp之間

17、呈正相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)HIF-1α和P-gp的表達(dá)可以更好的判斷腫瘤對(duì)化療的敏感性，指導(dǎo)臨床治療。 2．在ANNBC中HIF-1α表達(dá)與P-gp之間呈正相關(guān)；缺氧培養(yǎng)條件下，MCF-7、MCF-7/ADR細(xì)胞中HIF-1α和P-gp在mRNA、蛋白水平上表達(dá)均升高，并且兩者的表達(dá)有時(shí)效相關(guān)性，提示HIF-1α與腫瘤MDR密切相關(guān)，HIF-1α可作為逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的-個(gè)新靶點(diǎn)。 3．體內(nèi)外應(yīng)用反義真核表達(dá)載體antis

18、enseHIF-1α/pcDNA3.0可以顯著降低缺氧細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而可以部分逆轉(zhuǎn)缺氧條件下由P-gp介導(dǎo)的MDR。同時(shí)asHIF-1α/pcDNA3.0可以引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡、減少周期阻滯等，在逆轉(zhuǎn)非P-gp介導(dǎo)的MDR中有-定作用。 4．體內(nèi)外過表達(dá)抑癌基因PTEN可以抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α的生成，與反義缺氧誘導(dǎo)因子-1α聯(lián)合轉(zhuǎn)染可以更加顯著地降低缺氧細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)，所以能夠更大程度的逆轉(zhuǎn)缺氧條件下