新型乳腺癌耐藥細胞的建立、鑒定及耐藥逆轉(zhuǎn).pdf

1、惡性腫瘤已成為人類的第一殺手,嚴重危害人類的生命健康。今后20年內(nèi)全球癌癥患者人數(shù)還將快速上升。目前,化療是治療腫瘤的最主要途徑之一。然而腫瘤耐藥往往造成化療失敗,從而導(dǎo)致患者病情惡化甚至死亡。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,90％以上腫瘤患者的死亡與腫瘤耐藥相關(guān)。因此,如何克服腫瘤耐藥是成功治療惡性腫瘤急需解決的關(guān)鍵問題之一。
　　 腫瘤細胞株是腫瘤研究的重要工具。很多腫瘤相關(guān)的研究都不能以患者為直接作用對象,必須先以體外培養(yǎng)的腫瘤細胞株為研究

2、對象進行研究和評估。體外建立腫瘤耐藥細胞株可以為闡明腫瘤耐藥機制和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥奠定基礎(chǔ)。本研究以人乳腺癌細胞BCap37為親代細胞,以紫杉醇為篩選藥物,使用兩種不同的“兩階篩選法”成功建立乳腺癌耐藥細胞株Bats-72和Bads-200。其中Bats-72是基于紫杉醇高劑量沖擊誘導(dǎo)且時間遞增的“兩階篩選法”建立,Bads-200是基于紫杉醇低劑量持續(xù)誘導(dǎo)且劑量遞增的“兩階篩選法”建立。Bats-72和Bads-200的耐藥性狀存在相似之

3、處。細胞鑒定發(fā)現(xiàn)Bats-72和Bads-200在體外增殖速度不同程度的慢于BCap37,但兩者在體內(nèi)的增殖速度均快于BCap37。相對于親代細胞BCap37,Bats-72和Bads-200在體內(nèi)和體外都不同程度地耐受紫杉醇介導(dǎo)的細胞毒性、細胞周期停滯和細胞凋亡。但是Bats-72和Bads-200的耐藥性狀存在顯著差異。首先,Bats-72對MDR類化療藥物的耐受程度低于Bads-200；其次,Bats-72的耐藥譜寬于Bads-2

4、00；最后,在無紫杉醇的培養(yǎng)條件下,Bats-72的耐藥性長期穩(wěn)定,而Bads-200的耐藥性逐漸下降,直至完全消失。
　　 由此可見,新型乳腺癌耐藥細胞Bats-72和Bads-200的起源相同、篩選藥物也相同,只是建立方法不同,導(dǎo)致兩者的耐藥性狀存在顯著差異,分別代表著兩種不同的耐藥類型。BCap37,Bats-72和Bads-200這組細胞模型對系統(tǒng)地研究乳腺癌耐藥具有一定的科研價值。為進一步闡明乳腺癌耐藥機制和尋找潛在的

5、可臨床應(yīng)用的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)途徑,本研究開展了一系列實驗研究。
　　 ABC通道蛋白通過將化療藥物轉(zhuǎn)運至細胞外,使細胞內(nèi)始終維持較低的藥物濃度,從而導(dǎo)致腫瘤細胞耐藥,是最為經(jīng)典的腫瘤耐藥機制之一。文獻報導(dǎo)與腫瘤耐藥相關(guān)的ABC通道蛋白多達15種,其中P-gp、BCRP和MRP1介導(dǎo)的腫瘤耐藥最為常見,相關(guān)的研究也最為深入。本研究發(fā)現(xiàn)ABC通道蛋白功能調(diào)節(jié)劑維拉帕米和粉防己堿可以有效逆轉(zhuǎn)Bats-72和Bads-200的耐藥性。這提示

6、ABC通道蛋白可能參與介導(dǎo)Bats-72和Bads-200細胞耐藥。通過cDNA表達譜芯片、RT-PCR和Western Blot等實驗檢測,我們研究發(fā)現(xiàn)ABC通道蛋白的表達差異對Bats-72和Bads-200的耐藥特性起了關(guān)鍵作用。Bats-72和Bads-200均過表達ABCB1及其編碼蛋白P-gp,但前者的表達量低于后者。這為Bats-72和Bads-200均耐受MDR類藥物,但前者對MDR類化療藥物的耐受程度低于后者提供了理論

7、依據(jù)。ABCG2和ABCC6只在Bats-72表達上調(diào),從而介導(dǎo)Bats-72耐受甲氨蝶呤和吉西他濱等藥物。這為Bats-72的耐藥譜寬于Bads-200提供了理論依據(jù)。此外,在無紫杉醇的培養(yǎng)條件下,P-gp在Bats-72細胞中的表達長期穩(wěn)定,而在Bads-200細胞中的表達逐漸下降。這為Bats-72的耐藥性長期穩(wěn)定,而Bads-200的耐藥性逐漸下降,直至完全消失提供了理論依據(jù)。
　　 腫瘤耐藥往往是多因素參與,多種耐藥機

8、制同時存在并相互影響。具體的耐藥機制非常復(fù)雜,人們對其了解依然有限。研究已證實的腫瘤耐藥靶蛋白有P-gp、BCRP、MRP1、拓撲異構(gòu)酶Ⅱ、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、蛋白激酶C(PKC)等。本研究在使用單克隆抗體檢測相關(guān)細胞中P-gp的表達時,發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥細胞株Bats-72、Bads-200和MCF7／ADR中均表達一種分子量大于250 KDa的蛋白(M250),藥物敏感細胞BCap37則不表達M250。這提示M250與P-gp存在

9、同源性,且可能與腫瘤耐藥相關(guān)。本研究已成功分離得到M250,并計劃進一步鑒定M250是否為一種新的腫瘤耐藥標志物。
　　 氟維司群(Fulvestrant,ICI182,780)是一種已用于臨床治療乳腺癌的新型選擇性雌激素受體拮抗劑,能選擇性降解雌激素受體從而阻斷雌激素與受體結(jié)合。我們研究發(fā)現(xiàn)氟維司群可以逆轉(zhuǎn)雌激素受體介導(dǎo)乳腺癌對紫杉醇和長春新堿類藥物的耐藥。新型耐藥細胞株Bats-72和Bads-200均不表達ER-α。但是,

10、氟維司群可以有效逆轉(zhuǎn)Bats-72和Bads-200對紫杉醇介導(dǎo)的細胞毒性、細胞周期停滯和細胞凋亡的耐受,并呈劑量相關(guān)性。因此,我們證實了氟維司群不僅可以通過阻斷ER-α介導(dǎo)的信號通路發(fā)揮化療增敏作用,同時還存在不依賴于ER信號通路的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。
　　 綜上所述,本研究成功建立了乳腺癌耐藥細胞株Bats-72和Bads-200；明確了Bats-72和Bads-200分別代表兩種不同的耐藥類型；揭示了ABC通道蛋白的表達差異在B