白楊素逆轉(zhuǎn)乳腺癌干細(xì)胞相關(guān)亞群的耐藥性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/MX的建立及耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究 目的： 探討乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)抑制劑白楊素(Chrysin)逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX的耐藥性。 方法： 采用米托蒽醌濃度逐步增加的方法誘導(dǎo)建立MCF-7/MX耐藥細(xì)胞株；繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間來(lái)觀察MCF-7/MX細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)情況；應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞的BCRP蛋白表達(dá)；利用MTT比

2、色法觀察Chrysin聯(lián)合Mitoxantrone對(duì)MCF-7/MX細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果： 通過(guò)逐步增加培養(yǎng)液中米托蒽醌濃度(8nM、20nM、40nM、80nM、100nM)可建立乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/MX。耐藥細(xì)胞株生長(zhǎng)較親本細(xì)胞慢，其群體倍增時(shí)間為37.87小時(shí)，較親代細(xì)胞延長(zhǎng)了11.31小時(shí)。MTT比色法測(cè)定結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞株對(duì)米托蒽醌的耐藥指數(shù)為38，明顯高于親本細(xì)胞。在誘導(dǎo)過(guò)程中隨著藥物濃度的增加，

3、BCRP蛋白表達(dá)量逐漸增加，而在親本細(xì)胞中BCRP蛋白則不表達(dá)。相應(yīng)濃度的米托蒽醌(終濃度為0nM，40nM，80nM，100nM)作用后，BCRP蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.485±0.010、0.717±0.079、1.145±0.128、1.317±0.163，組間比較有差異性(P<0.05)。Chrysin(終濃度為2.5μM、5μM)作用48小時(shí)后，MCF-7/MX細(xì)胞對(duì)米托蒽醌I(xiàn)C50分別為1.851±0.02μM、0.62±0.2

4、17μM，與未加Chrysin的對(duì)照組(19.954±1.193μM)之間有差異性(P<0.05)。但對(duì)于MCF-7細(xì)胞，不同濃度的Chrysin(終濃度為0μM、2.5μM、5μM)作用后，細(xì)胞對(duì)米托蒽醌的IC50分別為0.532±0.004μM、0.493±0.023μM、0.471±0.051μM，各組間沒(méi)有差異性(P>0.05)。 結(jié)論： 1.MCF-7經(jīng)梯度濃度米托蒽醌誘導(dǎo)可建立耐藥細(xì)胞株MCF-7/MX；2.

5、從細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)見(jiàn)MCF-7/MX細(xì)胞對(duì)米托蒽醌高度耐藥；3.由BCRP蛋白介導(dǎo)，白楊素能逆轉(zhuǎn)MCF-7/MX細(xì)胞耐藥性。 第二部分：白楊素對(duì)人乳腺癌MCF-7/MX中癌干細(xì)胞亞群作用 目的： 探討白楊素對(duì)MCF-7/MX細(xì)胞中乳腺癌干細(xì)胞亞群CD44+CD24-的影響。 方法： 實(shí)驗(yàn)分為：1.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)MCF-7、MCF-7/MX細(xì)胞株CD44+CD24-細(xì)胞的比例及在米托蒽醌(終濃度為1

6、00nM)作用48小時(shí)后的CD44+CD24-細(xì)胞比例；2.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)MCF-7/MX細(xì)胞株用白楊素(終濃度為10-2μM、10-1μM、100μM、101μM)作用48小時(shí)后的CD44+CD24-細(xì)胞比例；3.細(xì)胞免疫熒光法和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)培養(yǎng)液中含有米托蒽醌(終濃度為100nM)的MCF-7/MX細(xì)胞，加入白楊素(終濃度為10-2μM、10-1μM、100μM、101μM)作用48小時(shí)后CD44+CD24-細(xì)胞比例。

7、 結(jié)果： 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF7、MCF7/MX細(xì)胞幾乎均為CD44陽(yáng)性，MCF7中表達(dá)CD44+CD24+細(xì)胞比例為95.041±2.146％，MCF7/MX中CD44+CD24+細(xì)胞比例為94.275±1.039％。表達(dá)CD44+CD24-的細(xì)胞僅為少部分，MCF-7中CD44+CD24-細(xì)胞比例為1.885±0.195％，MCF-7/MX的CD44+CD24-細(xì)胞比例為3.128±0.325％，兩者有顯著差異性(P<0

8、.05)。米托蒽醌(終濃度為100nM)作用MCF7或MCF7/MX細(xì)胞48小時(shí)后，MCF-7/MX中CD44+CD24-比例為3.254±0.128％與作用前沒(méi)有差異性(P>0.05)，而MCF-7中CD44+CD24-細(xì)胞比例為2.724±0.163％與作用前有差異性(P<0.05)。在含有米托蒽醌(100nM)的培養(yǎng)消液中，細(xì)胞免疫熒光法和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)Chrysin(終濃度為10-2μM、10-1μM、100μM、101μM

9、)作用MCF-7/MX細(xì)胞48小時(shí)后CD44+CD24-細(xì)胞的比例分別為2.684±0.226％、1.907±0.179％、1.414±0.112％、1.448±0.057％低于對(duì)照組3.128±0.325％(P<0.05)。各組間比較均有顯著差異性，呈濃度依賴關(guān)系(P<0.05)，但是我們發(fā)現(xiàn)101μM組與100μM組間無(wú)顯著差異性(P>0.05)。 結(jié)論： 1.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和細(xì)胞免疫熒光法證實(shí)白楊素可上調(diào)米托蒽醌對(duì)