外源蛋白介導(dǎo)的信號(hào)干擾對(duì)細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)及相關(guān)生理功能的影響.pdf

1、目前已知很多種類(lèi)的細(xì)菌可以通過(guò)小分子物質(zhì)進(jìn)行信號(hào)傳遞，從而調(diào)控各種生理行為，這種現(xiàn)象稱(chēng)為群體感應(yīng)(QS)，產(chǎn)生的信號(hào)分子叫做自體誘導(dǎo)物(AI)。目前對(duì)一些較典型的細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)已有很多相關(guān)研究，但其它細(xì)菌的研究仍大多局限于信號(hào)分子的檢測(cè)與相關(guān)基因的研究。由于缺乏相關(guān)的遺傳背景，而常規(guī)的篩選基因方法工作量較大(主要通過(guò)轉(zhuǎn)座子插入失活篩選突變菌株)，因此在細(xì)菌數(shù)量較多時(shí)存在許多實(shí)際研究困難。為了盡快了解這些細(xì)菌的群體感應(yīng)體系，采用向其中導(dǎo)

2、入源自根癌土壤桿菌的群體感應(yīng)調(diào)控蛋白TraR和AHLs水解酶AttM的方法，分別以群體感應(yīng)調(diào)控蛋白間的競(jìng)爭(zhēng)和降解自體誘導(dǎo)物的方式對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行信號(hào)干擾，從而快速了解未知群體感應(yīng)體系及其調(diào)控的生理功能。 土壤微生物根瘤菌可以與豆科植物共生，形成根瘤從而固定空氣中的N<,2>，這其中包括了一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，在許多根瘤茵中發(fā)現(xiàn)LuxR/LuxI類(lèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)是其中重要的調(diào)節(jié)因素之一，可以影響結(jié)瘤效率，共生體的形成，胞外多糖的產(chǎn)

3、生和固氮效率等，但目前對(duì)生長(zhǎng)速度介于快生型和慢生型之間的中慢生根瘤菌屬的相關(guān)報(bào)道很少。此外，人類(lèi)的腸道存在許多腸道細(xì)菌，但有時(shí)候這些共生茵群也會(huì)致病，群體感應(yīng)在細(xì)菌致病性的調(diào)控方面起到重要作用，包括生物膜的形成、毒素的產(chǎn)生、侵染的過(guò)程等。盡管已經(jīng)有很多人類(lèi)病原細(xì)菌群體感應(yīng)的相關(guān)研究，但在腸道細(xì)菌中，仍然只有少數(shù)和AHL類(lèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)有關(guān)的報(bào)道。因此本研究分別選擇中慢生根瘤菌(植物共生細(xì)菌)和杭州邵逸夫醫(yī)院提供的分離自高燒病人血液的十種臨

4、床腸道病原細(xì)菌(動(dòng)物病原細(xì)菌)作為研究對(duì)象。 在中慢生根瘤菌屬中，經(jīng)生物檢測(cè)和TLC發(fā)現(xiàn)，在TY培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，該屬產(chǎn)生信號(hào)分子的能力和類(lèi)別差別很大，有些菌株如中慢生型天山根瘤菌具有很高的AI活性，能夠產(chǎn)生7種不同結(jié)構(gòu)的AHLs，而中慢生型百脈根根瘤菌等在該條件下則活性很低，兩種中慢生型華癸根瘤菌的產(chǎn)生信號(hào)分子能力也有較大差異。 將遺傳分類(lèi)相近的根癌土壤桿菌群體感應(yīng)調(diào)控蛋白TraR分別導(dǎo)入中慢生型華癸根瘤菌Mh93和

5、中慢生型天山根瘤菌Mt3306中進(jìn)行超量表達(dá)，檢測(cè)對(duì)其群體感應(yīng)體系的影響，從而了解群體感應(yīng)系統(tǒng)在不同細(xì)菌中的特異性。結(jié)果顯示中慢生華癸根瘤茵Mh93自身群體感應(yīng)體系不能增強(qiáng)根癌土壤桿菌自體誘導(dǎo)物合成酶基因traI的表達(dá)，可能因?yàn)椴荒茏R(shí)別traI啟動(dòng)子序列，或者調(diào)控基因表達(dá)水平低。而根癌土壤桿菌調(diào)控蛋白TraR能夠與非同源性的Mh93的AI分子相結(jié)合，并且結(jié)合后的復(fù)合體具有活性，能夠增強(qiáng)traI的表達(dá)，但不能識(shí)別Mh93群體感應(yīng)系統(tǒng)目的蛋

6、白序列，兩種細(xì)菌群體感應(yīng)體系之間既有一致性，又有特異性。在天山根瘤菌Mt3306中也得到了類(lèi)似的結(jié)果。群體感應(yīng)體系中經(jīng)常存在競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象，調(diào)控蛋白可以與不同的AI信號(hào)分子結(jié)合，但親和力不同。TraR蛋白的導(dǎo)入造成種間競(jìng)爭(zhēng)，被強(qiáng)表達(dá)的TraR比中慢生根瘤菌自身調(diào)控蛋白優(yōu)先與AI緊密結(jié)合，但卻不能激活目的基因的表達(dá)，使得根瘤菌的調(diào)控蛋白與AI的結(jié)合受到限制，尤其是對(duì)產(chǎn)生自體誘導(dǎo)物能力不是很強(qiáng)的Mh93的影響更大，目標(biāo)細(xì)菌的群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)受到一

7、定程度的破壞。 AHL水解酶AttM對(duì)多種AHLs類(lèi)自體誘導(dǎo)物有顯著的降解效果，可以將AHLs水解形成生物活性大大降低的?；呓z氨酸。但將其轉(zhuǎn)A2Mh93后，發(fā)現(xiàn)AI沒(méi)有被降解，而對(duì)已知AI是AHLs結(jié)構(gòu)的A．tumefaciens R10和同樣是中慢生根瘤菌屬的Mt3306的AI則有明顯的降解作用，推測(cè)Mh93的自體誘導(dǎo)物分子并非大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌的AHLs的結(jié)構(gòu)。結(jié)合其它實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判斷Mh93產(chǎn)生的AI為環(huán)二肽結(jié)構(gòu)，Mt3306為

8、AHLs結(jié)構(gòu)，其中前者在根瘤菌中是非常罕見(jiàn)的。 與對(duì)照菌株相比，受TraR蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合影響，華癸根瘤菌Mh93的生物膜減淡，引起植物根毛卷曲的能力下降，但在根毛吸附和結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)中，能力只是略微下降。推測(cè)是因?yàn)門(mén)raR蛋白造成的對(duì)AI結(jié)合的種間競(jìng)爭(zhēng)只是暫時(shí)抑制了Mh93的群體感應(yīng)目標(biāo)基因的表達(dá)，在后期隨著未被外源調(diào)控蛋白捕獲的AI達(dá)到一定濃度，調(diào)控蛋白仍然能夠與AI進(jìn)行結(jié)合，發(fā)揮其生理效應(yīng)，從而使得各項(xiàng)生理功能都比其對(duì)照菌株遲滯

9、一段時(shí)間。而自體誘導(dǎo)物被AttM基本完全降解的天山根瘤菌的根毛吸附能力則明顯下降了約65％，說(shuō)明群體感應(yīng)可以正向調(diào)控天山根瘤菌對(duì)植物的根毛吸附能力。以上結(jié)果說(shuō)明，群體感應(yīng)體系能夠影響中慢生根瘤菌和宿主植物的一些作用過(guò)程，包括生物膜、根毛卷曲、根毛吸附等，證明其在共生固氮調(diào)節(jié)中具有重要作用。 在腸道細(xì)菌方面，通過(guò)對(duì)53株臨床分離的腸道細(xì)菌進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分和通氧量不同的4種方式培養(yǎng)后，有9株在至少一種培養(yǎng)條件下被檢測(cè)到AI活性，并且產(chǎn)生

10、能力因培養(yǎng)條件的不同而有多種差異。C<,18>反相薄板層析(TLC)顯示這些具有活性的腸道細(xì)菌都能產(chǎn)生一種以上的AHLs，盡管在不同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的同一種自體誘導(dǎo)物的濃度不一樣。而粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)SRRSH68在LB培養(yǎng)基、振蕩搖動(dòng)的培養(yǎng)條件下能夠比其它三種培養(yǎng)條件多產(chǎn)生一種結(jié)構(gòu)的AHL，說(shuō)明這些菌株的自體誘導(dǎo)物合成酶基因的表達(dá)受到生長(zhǎng)環(huán)境的影響和調(diào)控。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)于這樣無(wú)群體感應(yīng)相關(guān)基因

11、背景的大量菌株的研究如果通過(guò)逐個(gè)導(dǎo)入質(zhì)粒或者篩選其AI合成酶基因的方式進(jìn)行后繼研究，將會(huì)造成極大的工作量，所以本文通過(guò)另一種簡(jiǎn)單的方式來(lái)對(duì)其群體感應(yīng)體系進(jìn)行了初步定性分析。將能夠產(chǎn)生水解酶AttM的DH5a(pYC146)茵液與20種具有AI活性的腸道細(xì)菌菌液共培養(yǎng)一定時(shí)間后，檢測(cè)其胞外自體誘導(dǎo)物水平降低程度，以初步判斷其自體誘導(dǎo)物種類(lèi)。經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)后，這些菌株的自體誘導(dǎo)物濃度都有不同程度的降低，初步推測(cè)這些菌株包含AHLs類(lèi)結(jié)構(gòu)的自體誘

12、導(dǎo)物。部分降解效果不佳的菌株，可能因?yàn)槠渲泻卸喾N結(jié)構(gòu)的自體誘導(dǎo)物分子，包括AttM不能降解的結(jié)構(gòu)(如環(huán)二肽)，或者因?yàn)槊笇?duì)底物的專(zhuān)一性導(dǎo)致其對(duì)一些長(zhǎng)鏈AHLs降解效果不佳，但此種快速檢測(cè)方法值得借鑒。 在這種共培養(yǎng)初步定性的快速檢測(cè)過(guò)程中，S.marcescens SRRSH45不僅自體誘導(dǎo)物被降解，同時(shí)生物膜也明顯減淡，說(shuō)明群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)其生物膜的形成能力可以進(jìn)行正調(diào)控，同時(shí)也說(shuō)明這種檢測(cè)方式可以有效了解部分群體感應(yīng)調(diào)控的生