家蠶corazonin受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及生理功能的研究.pdf

1、神經(jīng)多肽是一類由多個(gè)氨基酸組成的內(nèi)源活性物質(zhì)，廣泛存在于生物各個(gè)門類中，在生物體內(nèi)參與了多種生理功能的調(diào)節(jié)，包括生長、發(fā)育、繁殖和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等。家蠶作為大型鱗翅目昆蟲，其基因組的測序已完成，可以作為研究神經(jīng)多肽功能的理想模型;另外，家蠶還具有十分重要的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此，研究神經(jīng)肽對家蠶生理功能的調(diào)節(jié)機(jī)制具有重大的實(shí)際意義。Corazonin(Crz)神經(jīng)肽作為昆蟲神經(jīng)多肽家族的重要一員，行使了心率加速、體色改變、物質(zhì)代謝增減、

2、發(fā)育與生理節(jié)律調(diào)控、蛻皮延遲、吐絲減少等非常廣泛的生理功能。Crz由11個(gè)氨基酸組成，結(jié)構(gòu)非常保守，在大部分昆蟲中是由前側(cè)腦的神經(jīng)元分泌，也有一些昆蟲可以由腹部和食管下神經(jīng)元分泌產(chǎn)生。然而，目前針對家蠶Crz神經(jīng)肽的生理功能及其受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究尚未得以深入開展。
　　 基于家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫資源，通過生物信息學(xué)方法，對已知的昆蟲神經(jīng)肽和神經(jīng)肽受體的序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)在進(jìn)化上比較保守的昆蟲（包括煙草天蛾和果蠅等）的神經(jīng)肽

3、Crz受體與家蠶神經(jīng)肽受體A21（BNGR-A21）有著高度的相似性，它們都是具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupledreceptor, GPCR)，推測家蠶BNGR-A21應(yīng)為其Crz受體。以此為基礎(chǔ)，對BNGR-A21介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293和昆蟲細(xì)胞BmN、Sf21中，BNGR-A21能唯一地被家蠶Crz激活，因此可以將家蠶的BNGR-A21定名為家蠶corazoni

4、n受體(Bombyx mori Corazonin Receptor,BmCrzR)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，BmCrz與BmCrzR有著高親和力，且BmCrzR被BmCrz激活后，能進(jìn)一步激活腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生第二信使cAMP的積累，并且這一反應(yīng)不能被百日咳毒素（PTX: Gαi蛋白的抑制劑）所抑制，也不能被霍亂毒素（CTX:持續(xù)性激活Gαs蛋白）所飽和;同時(shí)，BmCrzR被BmCrz激活后，可以檢測到較強(qiáng)的胞內(nèi)Ca2+信號，且這一反應(yīng)能被Gα

5、q的抑制劑YM-254890所抑制。以上結(jié)果表明cAMP和Ca2+作為第二信使共同參與了BmCrzR的下游的信號傳遞，也表明BmCrzR同時(shí)偶聯(lián)G∞和Gαq的G蛋白，介導(dǎo)了胞外至胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)作為重要的細(xì)胞信號傳遞因子廣泛參與生物多種生理過程的調(diào)控，它的直接作用靶點(diǎn)之一就是細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(Extracecullar Regu

6、lated protein Kinase，ERK1/2)。本研究的結(jié)果顯示，BmCrzR能顯著介導(dǎo)ERK1/2的磷酸化且呈現(xiàn)出配體濃度和時(shí)間梯度的依賴性,ERK1/2磷酸化程度受到蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)和胞外鈣離子的調(diào)控。
　　 內(nèi)吞是介導(dǎo)GPCR脫敏的重要機(jī)制。研究結(jié)果表明，BmCrzR的內(nèi)吞呈現(xiàn)BmCrz的處理時(shí)間和濃度依賴性，且可以被PKA、PKC的抑制劑和胞外鈣離子螯合劑的作用所抑制。由于β-arre

7、stin對GPCR的內(nèi)吞十分重要，本研究克隆了昆蟲中與β-arrestin同源的協(xié)助蛋白kurtz，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BmCrzR內(nèi)吞需要招募協(xié)助蛋白β-arrestin1、β-arrestin2和kurtz到細(xì)胞膜上，與β-arrestin1相比，受體招募β-arrestin2和kurtz有著更高的親和力。單獨(dú)干擾β-arrestin1或β-arrestin2的表達(dá)，受體的內(nèi)吞都不會受到明顯的影響，但同時(shí)干擾β-arrestin1和β-a

8、rrestin2的表達(dá)，BmCrzR的內(nèi)吞則受到了抑制。結(jié)果說明，BmCrzR的內(nèi)吞可以同時(shí)招募β-arrestin1和β-arrestin2，但是β-arrestin2和kurtz是BmCrzR內(nèi)吞主要的調(diào)控因子;另外，干擾網(wǎng)格蛋白表達(dá)后，BmCrzR的內(nèi)吞沒有受到影響，說明其內(nèi)吞不需要網(wǎng)格蛋白的協(xié)助。BmCrzR內(nèi)吞后，會進(jìn)入到早期內(nèi)含體，并在配體移除后回到細(xì)胞膜上。GPCR的C末端對于其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)吞是非常重要的，為了闡釋BmCr

9、zR構(gòu)效機(jī)制與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)間的關(guān)系，本研究構(gòu)建了BmCrzRC末端的四個(gè)缺失突變體，結(jié)果顯示BmCrzR(△408-422)的缺失突變體對BmCrzR的內(nèi)吞造成了影響，說明在第408-422區(qū)域的氨基酸中包含了與BmCrzR內(nèi)吞相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，正是這個(gè)區(qū)域中的411-413位的TSS絲氨酸/蘇氨酸簇在一定程度上影響了BmCrzR的內(nèi)吞。
　　 最后本研究對家蠶BmCrzR的基因表達(dá)組織分布進(jìn)行檢測，并采用基因沉默技術(shù)

10、從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平對其功能進(jìn)行分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的結(jié)果顯示，在五齡家蠶中，BmCrzR在大部分組織中都有表達(dá)，其中在后部絲腺中表達(dá)量最高，在腦、表皮、脂肪體、中腸、馬氏管、卵巢和睪丸中表達(dá)量相對較低。siRNA是近年來用于特異基因沉默的有效手段。我們體外注射了能夠干擾BmCrzR表達(dá)的dsRNA和家蠶Crz，結(jié)果表明BmCrz/BmCrzR可能直接或者間接的影響了家蠶的吐絲以及物質(zhì)和能量代謝。
　　 綜上所述，本論文豐富了