家蠶速激肽樣肽受體的功能性鑒定和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、速激肽作為神經(jīng)肽中的一大類，廣泛分布于脊椎動物和無脊椎動物的中樞神經(jīng)和外周組織中，在生物體內(nèi)參與調(diào)節(jié)多種多樣的生理功能。在昆蟲中，目前已從飛蝗、蟑螂、黑腹果蠅、蚊子等多種昆蟲中發(fā)現(xiàn)了與速激肽結(jié)構(gòu)相似的神經(jīng)肽，稱為速激肽樣肽。與速激肽一樣，速激肽樣肽主要分布于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)與腸道組織中，參與視覺、嗅覺等神經(jīng)調(diào)控以及促進(jìn)平滑肌收縮等生理功能。家蠶基因組中編碼了六個速激肽樣肽，然而關(guān)于家蠶速激肽樣肽受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制卻鮮有報道。
　　基

2、于已發(fā)現(xiàn)的昆蟲速激肽樣肽受體以及哺乳動物速激肽受體，我們對家蠶基因組數(shù)據(jù)序列比對和進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)家蠶孤兒神經(jīng)肽受體BNGR-A24，-A32和-A33可能是速激肽樣肽受體。本文克隆了這三個家蠶G蛋白偶聯(lián)受體，并利用哺乳動物細(xì)胞系HEK293和昆蟲細(xì)胞系Sf21兩套細(xì)胞異源表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定了這三個家蠶G蛋白偶聯(lián)受體。通過cAMP和鈣離子等功能性檢測方法和熒光競爭性結(jié)合方法，我們發(fā)現(xiàn)BNGR-A24選擇性的結(jié)合速激肽樣肽，是家蠶速激肽樣肽

3、受體，命名為BmTRPR?；罨蟮腂mTRPR能特異性結(jié)合Gs和Gq蛋白，引起第二信使cAMP和胞內(nèi)鈣離子水平的升高。BNGR-A32和-A33則被證明為與速激肽樣肽高度同源的的神經(jīng)肽Natalisin的特異性受體，分別命名為BmNTLR2和BmNTLR1。此外，我們鑒定了BmNTLR2的16堿基功能缺失突變體BmNTLR2-△16，推測BmNTLR2-△16在馴化過程中可能存在一定意義。
　　對速激肽受體BmTRPR的功能分析發(fā)

4、現(xiàn)，BmTRPR在被配體活化后，能夠發(fā)生受體的內(nèi)吞作用。在HEK293細(xì)胞中，BmTRPR的內(nèi)吞過程是一條依賴于網(wǎng)格蛋白，呈濃度梯度依賴型和時間梯度依賴型內(nèi)吞到早期內(nèi)含體，并在配體去除后重新回到細(xì)胞膜上。通過RNA干擾和特異性抑制劑處理的方法，我們發(fā)現(xiàn)BmTRPR受體內(nèi)吞依賴于GRK5，PKC及PKA的磷酸化，并且在受體磷酸化后能夠招募β-arrestin2，介導(dǎo)BmTRPR的內(nèi)吞。
　　除了受體內(nèi)吞作用，速激肽受體BmTRPR在

5、被配體活化后能引起與細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)MAPK信號通路的活化。我們在HEK293細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)BmTRPR可以濃度梯度和時間梯度依賴型激活ERK1/2通路。通過特異性抑制劑處理，我們發(fā)現(xiàn)TRP1活化的BmTRPR通過Gs/cAMP/PKA和Gq/PLCβ/PKC的途徑介導(dǎo)的ERK1/2磷酸化。此外，EGFR轉(zhuǎn)激活參與介導(dǎo)5min后的ERK1/2磷酸化。另外，利用β-arrestin1/2 siRNA特異性沉默HEK293細(xì)胞內(nèi)β-arr