玉米根系ZmOSMAPK1基因分離、功能鑒定及信號轉導作用.pdf

1、MAPK級聯(lián)途徑是真核生物中廣泛存在的信號轉導途徑。MAPK級聯(lián)途徑由三類蛋白激酶組成：MAPKKK-MAPKK-MAPK，通過依次磷酸化傳遞環(huán)境信號。植物中的MAPK途徑與其他信號途徑交織在一起，形成了一個網(wǎng)絡系統(tǒng)，參與生長發(fā)育和各種生物、非生物脅迫信號轉導。 近年來，在植物中分離到大量MAPKs，并在其作用機理研究方面取得了長足進展。然而，植物中MAPK的研究主要集中在雙子葉模式植物(如擬南芥、煙草和紫花苜蓿等)中，關于玉米

2、MAPK方面的研究很少。因此，本文以玉米Zheng958為試材，對玉米MAPK進行了基因克隆、序列比對、表達特性及其蛋白活性分析，并對其所參與的信號傳導途徑進行了深入研究。主要結果如下： 1.玉米中MAPK類蛋白激酶活性分析 利用MAPK專一底物MBP，通過溶液激酶試驗發(fā)現(xiàn)，干旱、高鹽和低溫均能誘導玉米中MAPK活性的迅速增加。表明在三種脅迫條件下，玉米MAPK級聯(lián)途徑起著重要作用。三種脅迫條件下激酶活性在2小時內達到較

3、高水平，隨后出現(xiàn)明顯下降，說明在玉米體內存在著有效的MAPK調控機制。三種脅迫處理所誘導的MAPK活性的最高值以及最高值出現(xiàn)的時間表現(xiàn)出較大差異，暗示著在不同脅迫條件下有不同的MAPK途徑被激活。外源信號分子H2O2、SA和ABA同樣能快速誘導MAPK激酶活性的增加。以上結果表明，MAPK級聯(lián)途徑在玉米的多種信號傳導中起著重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)外界刺激引起的MAPK的活化可被MEK激酶抑制劑PD98059所抑制，被蛋白質合成抑制劑CH

4、X所削弱，被磷酸酶抑制劑PAO所增強。 2.ZmOSMAPK1基因的分離及其特征 利用同源序列設計兼并引物，通過RT-PCR和RACE-PCR的方法從PEG脅迫的玉米根系中分離到一種MAPK基因，命名為ZmOSMAPK1(玉米滲透脅迫和鹽脅迫誘導促分裂原活化蛋白激酶1)。GenBbank注冊號為DQ422149。其全長為1627bp，編碼一個373氨基酸多肽段。序列分析表明，ZmOSMAPK1大部分氨基酸為疏水氨基酸，并

5、含有兩個推測的跨膜區(qū)，其中217-235aa處跨膜區(qū)具有較強的外向跨膜能力。序列比對發(fā)現(xiàn)ZmOSMAPK1具有11個保守亞區(qū)和TEY特征磷酸化位點，C端具有一個底物結合錨定位點(CDdomain)，與擬南芥AtMPK4和煙草NtMPK4有較高同源性，同屬于TEY類B組MAPK亞類。ZmOSMAPK1與已知功能的玉米MAPK蛋白親緣關系較遠，功能可能存在較大差異。 3.ZmOSMAPK1表達特性分析 Northern表達分

6、析表明，干旱誘導的ZmOSMAPK1在玉米根、莖和葉中均有表達，葉中誘導的表達水平最高，其次是根，莖中最少。ZmOSMAPK1能夠被干旱，高鹽誘導表達，然而4℃低溫并不能誘導ZmOSMAPK1表達產(chǎn)物的積累。信號分子SA，H2O2，ABA同樣能誘導ZmOSMAPK1表達增加。ZmOSMAPK1對不同刺激的響應模式有所不同，干旱誘導ZmOSMAPK1的表達持續(xù)時間要長于高鹽脅迫。信號分子SA、H2O2均能誘導該基因的快速表達，而ABA處理

7、下ZmOSMAPK1的表達遲于其他處理，表明ABA能夠以一種特殊的方式調控ZmOSMAPK1在玉米中表達。 4.ZmOSMAPK1蛋白激酶活性分析 外界刺激不僅能誘導ZmOSMAPK1轉錄產(chǎn)物的積累，而且能夠誘導ZmOSMAPK1激酶活性的增加。干旱、高鹽誘導的ZmOSMAPK1蛋白激酶活性的變化趨勢類似于ZmOSMAPK1轉錄產(chǎn)物積累，短時間內(1h)迅速上升，隨即(3h)下降。表明在干旱和高鹽條件下，ZmOSMAPK

8、1活化不僅需要蛋白質的磷酸化修飾過程，而且存在轉錄水平的調控。ZmOSMAPK1蛋白產(chǎn)物的活性變化要早于其轉錄產(chǎn)物的變化，暗示著ZmOSMAPK1的活性調控在蛋白質水平上更為靈敏。雖然低溫不能誘導ZmOSMAPK1轉錄產(chǎn)物的積累，但能迅速誘導ZmOSMAPK1的激酶活性，且持續(xù)時間較短，1h后明顯下降，這可能與ZmOSMAPK1轉錄不能被低溫所誘導有關。信號分子SA、H2O2處理發(fā)現(xiàn)，ZmOSMAPK1轉錄和激酶活性變化與PEG處理表現(xiàn)

9、出類似的結果。ABA不僅能持續(xù)誘導ZmOSMAPK1的轉錄活性，而且能誘導ZmOSMAPK1持續(xù)的蛋白激酶活性。這種同一種信號傳導途徑對不同外界刺激具有不同響應的機理還不清楚，尚需進一步的研究。利用H2O2清除劑DMTU研究發(fā)現(xiàn)，ZmOSMAPK1的活化需要玉米體內H2O2的積累，H2O2介導了環(huán)境信號在ZmOSMAPK1級聯(lián)途徑中的信號傳導過程。 5.ZmOSMAPK1超表達擬南芥植株表現(xiàn)出對干旱和NaCl脅迫抗性的提高

10、 轉基因擬南芥抗逆性試驗發(fā)現(xiàn)，轉基因擬南芥在干旱和鹽脅迫下能正常開花結實，而野生型植株則不能。進一步研究發(fā)現(xiàn)，脅迫條件下轉基因擬南芥中H2O2和MDA含量明顯低于野生型植株，具有更高的活性氧清除能力。這可能是轉基因植株抗性提高的主要原因之一。此外，轉基因擬南芥在脅迫條件下能保持較高水勢和較低滲透勢，具有較強的滲透調節(jié)能力。 6.ZmOSMAPK1參與了擬南芥SA的負調控過程 轉基因擬南芥中SA的積累和SA響應基因(PR

11、2和PR5)的表達受到極大抑制。SA處理擬南芥幼苗，野生型植株表現(xiàn)出較強的SA響應表型，植株矮小，生長變緩。這些結果證實了ZmOSMAPK1對SA的負調控作用。ZmOSMAPK1超表達擬南芥植株中JA響應基因(PDF1.2和THI2.1)的表達相對增強，而研究發(fā)現(xiàn)其同源物AtMPK4誘導JA響應基因表達的增強不依賴于SA水平，表明ZmOSMAPK1參與了JA信號傳導過程。以上結果表明，玉米ZmOSMAPK1是平衡和調節(jié)由植物抗病信號傳導