玉米ZmLTPL63基因的分離及功能鑒定.pdf

1、植物在生長發(fā)育過程中經常受到高溫、干旱、鹽等多種非生物脅迫的影響。這些逆境可以造成植物體內生理代謝障礙，嚴重影響作物的產量和品質。為了應對脅迫危害，植物在長期進化中形成了一套復雜而精密的防御機制，包括多重信號通路、各種轉錄因子及功能基因等。近年來研究發(fā)現，脂質轉運蛋白（Lipid Transfer Proteins, LTPs）在植物的生長發(fā)育調節(jié)及非生物脅迫響應中起著重要作用，但大多數LTPs的具體作用機理尚不清楚。
　　本研究

2、根據玉米熱帶種質POB21自選系響應高溫和干旱的轉錄組學差異，從中篩選到一個脅迫響應上調表達的功能未知 LTPs-like基因。根據玉米基因組數據庫MaizeGDB中B73基因組中參考基因DRMZM2G05208的序列，通過RT-PCR方法獲得同源克隆，命名為ZmLTPL63。對該基因的結構、進化關系、表達模式及生物學功能進行系統分析，主要研究結果如下：
　?。?）基因序列分析表明，該基因CDS全長759bp，編碼長252個氨基酸

3、的肽鏈。預測ZmLTPL63蛋白的分子量約25.9kD，在N末端存在長度為23個氨基酸的信號肽。蛋白具有典型的LTPs結構特征，肽鏈中8個位置特異的半胱氨酸殘基（8CM）可以配對產生4個二硫鍵，4個α螺旋折疊形成一個立體的疏水腔，可用來結合脂質分子。但與典型LTPs相比，ZmLTPL63編碼的氨基酸序列更長，并且在N端信號肽和8CM基序之間富含脯氨酸。蛋白種間同源比對及進化分析表明，ZmLTPL63在多種植物中存在同源蛋白，與粟XP_0

4、12699184.1、高粱XP_002439994.1、漸尖二型花屬OEL21002.1、粗山羊草EMT12664.1、二穗短柄草KQK15914.1及水稻BAC65920.1等蛋白存在較高同源性，而與擬南芥AT3G43720同源性較低。
　?。?）通過qRT-PCR方法分析玉米ZmLTPL63基因的表達模式，結果表明其可以響應多種脅迫、植物激素和信號分子。ZmLTPL63基因的表達具有一定的組織特異性，在幼苗中的表達水平表現為根

5、<莖<葉。ZmLTPL63可以受高溫、PEG模擬干旱、鹽（NaCl）誘導表達。脫落酸（ABA）、乙烯（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）和H2O2能顯著上調ZmLTPL63基因的表達水平，赤霉素（GA）處理后其表達水平出現下調。
　　（3）為確定ZmLTPL63蛋白的亞細胞定位，構建了pROKII-35S::ZmLTPL63-GFP融合表達載體并通過農桿菌瞬時侵染本生煙草葉片。利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光，發(fā)現ZmLTPL63-

6、GFP的熒光只出現在細胞外周。
　?。?）根據B73參考基因組序列克隆ZmLTPL63基因編碼區(qū)上游長1500bp的DNA序列。序列分析軟件預測表明啟動子存在真菌、高溫、干旱、低溫等多種（非）生物脅迫響應元件和MeJA等激素響應元件。pBI121-PZmLTPL63::GUS轉基因擬南芥幼苗的X-Gluc染色表明，基因在植株各器官中廣泛表達，尤其在莖尖和和根尖表達較高。ABA和H2O2處理能夠增強GUS表達，說明啟動子表達調控特性

7、與基因表達特性一致。
　　（5）組成型超表達ZmLTPL63基因能增強轉基因植株對干旱和鹽的非生物脅迫抗性。在脅迫條件下，超表達ZmLTPL63轉基因擬南芥比野生型幼苗根生長更快，成苗的存活率更高；轉基因擬南芥離體葉盤在滲透脅迫下的褪綠黃化明顯慢于野生型；同時，轉基因擬南芥離體葉片失水速率也低于野生型。與野生型相比，轉基因植株在干旱和高鹽脅迫下ROS的積累量較低，抗氧化酶的活性更高，丙二醛含量較少，對H2O2的敏感性降低。以上結果

8、表明超表達ZmLTPL63可以通過提高植株抗氧化能力來增加對干旱和鹽脅迫的耐受性。
　?。?）在本生煙葉片中瞬時表達ZmLTPL63，氣相色譜檢測表明葉片中不飽和脂肪酸如亞油酸、亞麻酸較對照明顯上升。說明ZmLTPL63參與脂肪酸代謝的調節(jié)。
　?。?）表達ZmLTPL63影響植株的生長發(fā)育進程。轉基因擬南芥在生長發(fā)育后期表現為抽苔和開花延遲。qRT-PCR結果發(fā)現，參與開花正向調控的關鍵基因的表達量明顯降低，推測ZmLTP