拮抗酵母誘導(dǎo)番茄果實抗性基因的分離與功能鑒定.pdf

1、果實采后真菌性病害造成的經(jīng)濟損失是巨大的。長期以來防治果實的真菌病害一直是使用化學(xué)殺菌劑，而化學(xué)殺菌劑早就被證實有害于人體健康，因而開發(fā)安全無害的果蔬保鮮劑具有重要意義。利用具有拮抗活性的酵母菌種開展生物防治的方法是最有希望替代化學(xué)殺菌劑的方法之一。羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)是國內(nèi)外研究較多的采后拮抗酵母。目前研究認為生防酵母預(yù)防采后病原菌的主要作用機制包括：營養(yǎng)與空間競爭、直接與病原微生物作用和誘導(dǎo)寄

2、主抗性三個方面，其中營養(yǎng)與空間競爭被認為是生防酵母主要的作用方式。越來越多的證據(jù)表明，生防酵母可以誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性，并且這種抗性在采后儲存中抵御采后病原微生物的侵染起到了重要的作用。本文以番茄果實為實驗材料，主要分為三部分。第一部分，以抑制差減雜交(SSH)和番茄基因芯片方法篩選出羅倫隱球酵母處理后櫻桃番茄果實差異表達的基因；從芯片和SSH結(jié)果中選出4個差異表達的基因；第二部分，克隆了這四個基因的開放閱讀框ORF(Open Readin

3、g Frame)并將其轉(zhuǎn)入到擬南芥中以待對其功能進行深入研究。第三部分，用羅倫隱球酵母對番茄進行處理，檢測櫻桃番茄果實在羅倫隱球酵母和1-MCP單獨和結(jié)合處理下對番茄果實抗性相關(guān)酶活性的影響；其主要研究結(jié)果如下：
　　 ⑴以生防菌處理后果實cDNA為‘tester’，以無菌水處理的為‘driver’構(gòu)建抑制差減雜交(SSH)文庫。通過對SSH文庫的篩選得到50個差異表達基因，其中33個為已知功能，在已知功能的基因中主要是抗性相關(guān)

4、和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因，而這些基因在其他的脅迫條件下也有上調(diào)表達，因此認為正是這些基因的上調(diào)表達，增強了番茄果實在生防菌處理后對采后病害的抗性。
　　 ⑵通過番茄基因芯片雜交，我們觀察到在生防酵母處理后番茄果實約有4200個基因的表達發(fā)生了變化，約占番茄基因總數(shù)的12％。通過進一步的篩選芯片雜交結(jié)果，我們得到了531個差異表達明顯的基因。其中上調(diào)表達基因219個，其中96為已知功能，123個功能未知：下調(diào)表達基因312個其中個16

5、8為已知功能，144個功能未知。在上調(diào)表達已知功能的基因中主要包括如下幾類：基礎(chǔ)代謝22個占已知基因10％；抗性相關(guān)基因17個占已知基因7.7％；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)10個占已知基因4.5％；；在下調(diào)表達已知功能的基因中主要包括如下幾類：基礎(chǔ)代謝41個占已知基因13％；光合作用24個占已知基因7.7％；能量代謝相關(guān)21個占已知基因6.7％。
　　 ⑶通過對基因芯片的結(jié)果分析，得到如下的結(jié)論：生防菌處理番茄果實后，可以激發(fā)SA介導(dǎo)的SAR反應(yīng)

6、，抑制JA/ET介導(dǎo)的其他抗性反應(yīng)。而且生長素介導(dǎo)的抗性反應(yīng)也可能在生防酵母處理下起到一定的作用。同時生防酵母處理后可以明顯的抑制番茄果實中光合作用和能量代謝相關(guān)基因的表達。
　　 ⑷為進一步研究相關(guān)基因的功能，我們克隆得到了4個基因的ORF并構(gòu)建了過表達載體，并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)擬南芥中，通過除草劑篩選，目前已經(jīng)得到擬南芥轉(zhuǎn)基因苗。
　　 ⑸以綠熟期櫻桃番茄果實為試驗材料，用1μl/L濃度1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)進行處理24

7、小時，在室溫條件下自然貯藏，研究1-MCP處理對番茄果實抗性相關(guān)酶：過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、脂肪氧合酶(LOX)活性和丙二醛(MDA)含量的影響。結(jié)果表明：1-MCP處理可以抑制LOX和PAL的活性；刺激CAT活性峰值提前；提高MDA含量；刺激PPO和POD活性上升，但是1-MCP處理對SOD活性影響不大。1-MCP和羅倫隱球酵母結(jié)合處理可以刺