拮抗酵母誘導(dǎo)番茄果實(shí)抗性基因的分離與功能鑒定.pdf

1、果實(shí)采后真菌性病害造成的經(jīng)濟(jì)損失是巨大的。長期以來防治果實(shí)的真菌病害一直是使用化學(xué)殺菌劑，而化學(xué)殺菌劑早就被證實(shí)有害于人體健康，因而開發(fā)安全無害的果蔬保鮮劑具有重要意義。利用具有拮抗活性的酵母菌種開展生物防治的方法是最有希望替代化學(xué)殺菌劑的方法之一。羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)是國內(nèi)外研究較多的采后拮抗酵母。目前研究認(rèn)為生防酵母預(yù)防采后病原菌的主要作用機(jī)制包括：營養(yǎng)與空間競爭、直接與病原微生物作用和誘導(dǎo)寄

2、主抗性三個(gè)方面，其中營養(yǎng)與空間競爭被認(rèn)為是生防酵母主要的作用方式。越來越多的證據(jù)表明，生防酵母可以誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性，并且這種抗性在采后儲(chǔ)存中抵御采后病原微生物的侵染起到了重要的作用。本文以番茄果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，主要分為三部分。第一部分，以抑制差減雜交(SSH)和番茄基因芯片方法篩選出羅倫隱球酵母處理后櫻桃番茄果實(shí)差異表達(dá)的基因；從芯片和SSH結(jié)果中選出4個(gè)差異表達(dá)的基因；第二部分，克隆了這四個(gè)基因的開放閱讀框ORF(Open Readin

3、g Frame)并將其轉(zhuǎn)入到擬南芥中以待對(duì)其功能進(jìn)行深入研究。第三部分，用羅倫隱球酵母對(duì)番茄進(jìn)行處理，檢測櫻桃番茄果實(shí)在羅倫隱球酵母和1-MCP單獨(dú)和結(jié)合處理下對(duì)番茄果實(shí)抗性相關(guān)酶活性的影響；其主要研究結(jié)果如下：
　　 ⑴以生防菌處理后果實(shí)cDNA為‘tester’，以無菌水處理的為‘driver’構(gòu)建抑制差減雜交(SSH)文庫。通過對(duì)SSH文庫的篩選得到50個(gè)差異表達(dá)基因，其中33個(gè)為已知功能，在已知功能的基因中主要是抗性相關(guān)

4、和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因，而這些基因在其他的脅迫條件下也有上調(diào)表達(dá)，因此認(rèn)為正是這些基因的上調(diào)表達(dá)，增強(qiáng)了番茄果實(shí)在生防菌處理后對(duì)采后病害的抗性。
　　 ⑵通過番茄基因芯片雜交，我們觀察到在生防酵母處理后番茄果實(shí)約有4200個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了變化，約占番茄基因總數(shù)的12％。通過進(jìn)一步的篩選芯片雜交結(jié)果，我們得到了531個(gè)差異表達(dá)明顯的基因。其中上調(diào)表達(dá)基因219個(gè)，其中96為已知功能，123個(gè)功能未知：下調(diào)表達(dá)基因312個(gè)其中個(gè)16

5、8為已知功能，144個(gè)功能未知。在上調(diào)表達(dá)已知功能的基因中主要包括如下幾類：基礎(chǔ)代謝22個(gè)占已知基因10％；抗性相關(guān)基因17個(gè)占已知基因7.7％；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)10個(gè)占已知基因4.5％；；在下調(diào)表達(dá)已知功能的基因中主要包括如下幾類：基礎(chǔ)代謝41個(gè)占已知基因13％；光合作用24個(gè)占已知基因7.7％；能量代謝相關(guān)21個(gè)占已知基因6.7％。
　　 ⑶通過對(duì)基因芯片的結(jié)果分析，得到如下的結(jié)論：生防菌處理番茄果實(shí)后，可以激發(fā)SA介導(dǎo)的SAR反應(yīng)

6、，抑制JA/ET介導(dǎo)的其他抗性反應(yīng)。而且生長素介導(dǎo)的抗性反應(yīng)也可能在生防酵母處理下起到一定的作用。同時(shí)生防酵母處理后可以明顯的抑制番茄果實(shí)中光合作用和能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 ⑷為進(jìn)一步研究相關(guān)基因的功能，我們克隆得到了4個(gè)基因的ORF并構(gòu)建了過表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)擬南芥中，通過除草劑篩選，目前已經(jīng)得到擬南芥轉(zhuǎn)基因苗。
　　 ⑸以綠熟期櫻桃番茄果實(shí)為試驗(yàn)材料，用1μl/L濃度1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)進(jìn)行處理24

7、小時(shí)，在室溫條件下自然貯藏，研究1-MCP處理對(duì)番茄果實(shí)抗性相關(guān)酶：過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、脂肪氧合酶(LOX)活性和丙二醛(MDA)含量的影響。結(jié)果表明：1-MCP處理可以抑制LOX和PAL的活性；刺激CAT活性峰值提前；提高M(jìn)DA含量；刺激PPO和POD活性上升，但是1-MCP處理對(duì)SOD活性影響不大。1-MCP和羅倫隱球酵母結(jié)合處理可以刺