番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定、遺傳多樣性分析及其誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的分離.pdf

1、番茄（Solanum lycopersicum Mill.）由于其營(yíng)養(yǎng)豐富，口味獨(dú)特，已成為世界性的蔬菜作物之一。隨著番茄栽培面積的增加，諸多不利因素（如生物脅迫和非生物脅迫）制約了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中番茄黃化曲葉病毒病(Tomato Yellow Leaf Curl VirusDisease，TYLCD)是番茄生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一。為了更有效地分析其致病機(jī)理，本研究克隆浙江省番茄黃化曲葉病毒(Tomato Yellow Leaf C

2、url Virus，TYLCV)分離物的全長(zhǎng)序列，分析其結(jié)構(gòu)特征，序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系;為了進(jìn)一步分析其遺傳多樣性，我們從NCBI網(wǎng)站上檢索TYLCV，分析來(lái)源于29個(gè)國(guó)家48個(gè)地區(qū)TYLCV的基因結(jié)構(gòu)、GC含量、保守性比對(duì)及其遺傳變異;此外，利用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)抗感番茄接種前后病毒含量的差異，討論與其抗性程度的相關(guān)性;最后，利用cDNA-AFLP技術(shù)分離了TYLCV誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因。研究結(jié)果如下:
　

3、　 1.TYLCV的分子鑒定及序列分析
　　 運(yùn)用PCR技術(shù)克隆并鑒定了浙江省杭州地區(qū)TYLCV分離物，病毒基因全長(zhǎng)為2781個(gè)核苷酸，共編碼6個(gè)開放閱讀框（AV1、AV2、AC3、AC2、AC1、AC4），即為TYLCV的典型結(jié)構(gòu);核苷酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該病毒分離物與美國(guó)的TYLCV同源性最高(99.6％);6個(gè)編碼區(qū)分析顯示除云南外，AV2與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)同源性均高達(dá)100％;系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析表明病毒分離物與江蘇、北京、美國(guó)

4、、墨西哥的TYLCV劃分為一類，親緣關(guān)系最近。
　　 2.TYLCV的遺傳多樣性分析
　　 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)上共檢索到48個(gè)TYLCV; GC含量分析表明沒(méi)有較大差異，隨著核苷酸長(zhǎng)度的變化趨勢(shì)較一致;序列比對(duì)表明這些TYLCV的保守性很高;系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析這些TYLCV被分為10類;同源性分析顯示，序列間差異較大，序列間同源性最低為72.8％，最高為98.6％。
　　

5、 3.TYLCV的定量分析
　　 利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)抗、感番茄材料在接種后不同時(shí)期病毒含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明:接種后同一時(shí)期抗病材料的病毒含量總體低于感病材料;除TY-1+2+3+5番茄材料，其它抗病番茄材料的病毒含量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);番茄材料的病毒含量與抗性呈現(xiàn)一致性。
　　 4.運(yùn)用cDNA-AFLP技術(shù)分離番茄抗TYLCV的差異表達(dá)基因
　　 利用cDNA-AFLP技術(shù)分離抗病

6、番茄在接種后不同時(shí)期的差異表達(dá)基因，結(jié)果表明:共篩選出287條轉(zhuǎn)錄差異片段，其中156條上調(diào)表達(dá)，131條下調(diào)表達(dá);對(duì)其中15個(gè)轉(zhuǎn)錄表達(dá)片段（Transcript-derived fragment，TDF）進(jìn)行序列分析，11個(gè)TDF與NCBI已有序列同源，功能涉及代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA結(jié)合以及逆境誘導(dǎo)蛋白，另有4個(gè)TDF無(wú)同源序列或同源性低，預(yù)測(cè)是一些未知功能基因。
　　 總之，這些結(jié)果一方面為今后揭示TYLCV的致病