玉米逆境響應相關基因ZmUBP的功能鑒定與WRKY基因家族進化分析.pdf

1、玉米是我國種植面積最大的糧食作物。生物與非生物逆境脅迫嚴重影響玉米的產量和品質，抗逆育種已成為玉米遺傳改良的重要方向，因此發(fā)掘和研究抗逆相關基因及其功能并進行分子育種，是培育抗逆新品種提高玉米產量和品質的一種有效途徑。泛素特異性蛋白酶（Ubiquitin-Specific Protease, UBP）是一類廣泛存在于真核生物中的保守性很高的蛋白，它們通過脫泛素化作用調節(jié)生長發(fā)育。在植物抗逆過程中，UBP蛋白也有著重要的作用，但迄今關于玉

2、米中該蛋白基因家族的功能還未見報道。本研究通過對玉米基因組ZmUBP家族分析，克隆了玉米中 UBP14， ZmUBP16a，ZmUBP16b和 ZmUBP16c，并對這些基因的功能進行了分析鑒定；同時對玉米及其他禾本科物種中抗逆相關的WRKY轉錄因子家族進行了分子進化的研究。獲得了以下主要結果：
　　1、蛋白質結構域分析表明，ZmUBP14和ZmUBP16a/b/c均含有UBP結構域。組織表達模式分析顯示，它們在玉米生長的各個時期

3、都普遍表達。不同的非生物脅迫處理下，ZmUBP16a，ZmUBP16b和ZmUBP16c能夠響應脫落酸誘導、鹽離子及重金屬脅迫。通過構建ZmUBP14-GFP和ZmUBP16a/b/c-GFP載體并轉化擬南芥，研究 ZmUBP14和 ZmUBP16a/b/c的蛋白定位，結果表明ZmUBP14-GFP融合蛋白定位在細胞核中，ZmUBP16a-GFP，ZmUBP16b-GFP和ZmUBP16c-GFP融合蛋白均定位在細胞膜上。
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4、、通過構建ZmUBP16a，ZmUBP16b和ZmUBP16c過表達載體，分別轉化擬南芥 ubp16功能缺失突變體，結果顯示，這三個蛋白均能回補擬南芥 ubp16功能缺失突變體的表型。在擬南芥中分別過表達玉米ZmUBP16a，ZmUBP16b和ZmUBP16c，分析表明，ZmUBP16a，ZmUBP16b和ZmUBP16c的過表達并不影響植株的抗鹽性，在經100mM NaCl處理后，過表達植株的表型與空載體對照無明顯差異；在0.5μM

5、ABA的處理下，過表達植株的發(fā)芽率在比空載體對照低了約50％，過表達ZmUBP16a和ZmUBP16b的植株表現(xiàn)出對CdCl2明顯的不敏感性；因此說明，過表達 ZmUBP16a，ZmUBP16b和 ZmUBP16c能夠提高了擬南芥對ABA的敏感性和對重金屬的抗性。
　　3、通過對抗逆相關基因的表達分析，發(fā)現(xiàn)逆境條件下， ZmUBP16a， ZmUBP16b和 ZmUBP16c過表達植株中的抗逆功能基因的表達水平顯著提高，抗重金屬相

6、關基因如AtABCC1，AtABCC2和AtPCS在鎘處理后表達量明顯高于對照；ABA通路基因以及與ABA合成相關基因（如AtNCED3，AtMYB2，AtRD22）的表達量也明顯高于對照植株，而不依賴于ABA的抗逆基因AtCBF表達量變化不大。結果表明，ZmUBP16a, ZmUBP16b和 ZmUBP16c是通過ABA信號轉導途徑參與離子脅迫應答。
　　4、為進一步確認ZmUBP16a在重金屬脅迫下的作用機制，本研究選取了野生

7、型以及 ZmUBP16a過表達植株在金屬鎘處理前后的植株樣品，進行高通量轉錄組測序，通過表達差異分析發(fā)現(xiàn)，ZmUBP16a過表達引起的上調基因中，大部分為代謝相關基因，包括糖代謝、能量代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝，在重金屬鎘處理后，這些代謝相關基因在過表達和野生型植株中大多呈現(xiàn)下調表達。在過表達和重金屬處理都能引起上調表達的有3個功能基因，其中AT1G05680是活性氧（ROS）和植物激素信號轉導途徑中有重要的作用的基因。<

8、br>　　5、通過構建ZmUBP14過表達載體，并轉化擬南芥ubp14功能缺失突變體。分析結果表明，過表達玉米ZmUBP14基因能夠回補擬南芥ubp14功能缺失突變體的表型。利用Pull-down分析技術，發(fā)現(xiàn)ZmUBP14和玉米抗逆相關轉錄因子ZmTCP15a以及ZmTCP15b在體外存在互作；雙分子熒光互補（BiFC）技術分析也表明，ZmUBP14分別和 ZmTCP15a/b在植物體內也存在互作關系。因此ZmUBP14可能是與ZmT