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文檔簡介
1、促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)級聯(lián)途徑是存在于真核生物中的高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。典型的MAPK級聯(lián)途徑由三種蛋白激酶組成,即MAPK(MPK)、MAPKK(MKK、MEK)和MAPKKK(MEKK),并通過MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化作用將信號傳遞放大。MAPK級聯(lián)途徑在植物生長發(fā)育及多種逆境響應(yīng)中起重要作用。本研究從全基因組水平對兩種重要蔬菜作
2、物,番茄和黃瓜中的MAPK級聯(lián)途徑基因家族成員進(jìn)行鑒定,并對它們的分類、保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)特征等進(jìn)行了分析。同時利用生物信息學(xué)方法分析了MAPK級聯(lián)途徑相關(guān)基因家族在植物中的分布及進(jìn)化關(guān)系。為進(jìn)一步探究MAPK基因在番茄生長發(fā)育過程中的功能,在分離番茄雄蕊優(yōu)勢表達(dá)基因SlMPK13的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)行了亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)體外原核表達(dá)、體外磷酸化活性以及表達(dá)特征分析。隨后利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)研究了SlMPK13在番茄營養(yǎng)生
3、長、花器官形態(tài)發(fā)育及花粉發(fā)育中的功能,并利用RNA-seq技術(shù)探索了其在花粉發(fā)育中的作用機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
(1)利用同源比對和HMMER搜索,在番茄基因組中共鑒定了89個MAPKKKs、5個MAPKKs和1個新的MAPK基因;在黃瓜基因組中共鑒定了59個MAPKKKs、6個MAPKKs和14個MAPKs。多序列比對、保守基序和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明,植物MAPK和MAPKK基因家族分為A、B、C、D四個亞組,而MAPKK
4、K基因家族則分為MEKK、RAF和ZIK三個亞組。實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析結(jié)果顯示,多數(shù)番茄和黃瓜MAPK級聯(lián)途徑基因在多個植物器官中普遍表達(dá),且參與多種逆境脅迫和激素的響應(yīng)過程。
(2)進(jìn)化分析顯示,MAPKKK家族的基因數(shù)目在不同植物中差異很大;植物MAPKKK家族在藻類植物進(jìn)化以前就已完成三個亞族的分化;隨著進(jìn)化歷程的演變,植物MAPKKK家族主要發(fā)生了兩次基因數(shù)目的迅速擴(kuò)增,分別發(fā)生在藻類植物到苔蘚植物
5、以及蕨類植物到開花植物的進(jìn)化過程中,且植物MAPKKK基因數(shù)目的大量擴(kuò)增主要發(fā)生在RAF亞族內(nèi)。植物MAPKK家族A、B兩個亞組的基因起源較早,在藻類植物中就已經(jīng)存在;而C、D亞組MAPKK基因成員直到開花植物才出現(xiàn)。植物MAPK基因家族的迅速擴(kuò)增發(fā)生在蕨類植物到開花植物的進(jìn)化過程中,且主要發(fā)生在D亞組內(nèi);C、D兩個亞組MAPK基因起源于藻類植物進(jìn)化以前,A、B亞組的MAPK基因在苔蘚植物中也已出現(xiàn)。
(3)QRT-PCR及原
6、位雜交結(jié)果表明,SlMPK13在番茄植株的多個器官/組織以及雄蕊的不同發(fā)育時期中都有表達(dá),但在開放花的雄蕊中尤其是成熟花粉中優(yōu)勢表達(dá)。體外原核表達(dá)表明,SlMPK13編碼一個大小約為44 kDa的水溶蛋白。將該蛋白與磷酸化的酪氨酸抗體進(jìn)行Westem雜交,結(jié)果顯示其具有體外磷酸化的活性;亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,S1MPK13定位在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。
(4)構(gòu)建了花椰菜花葉病毒CaMV35S組成型啟動子啟動的RNA干擾載體p
7、35S∷slmpk13-RNAi,并利用“葉盤法”遺傳轉(zhuǎn)化番茄品種‘Micro-Tom’。觀察轉(zhuǎn)基因后代發(fā)現(xiàn),植株表現(xiàn)出生長矮小、葉片發(fā)育畸形、根發(fā)育受抑制、花器官異常肥大、雄蕊頂端開裂等多種表現(xiàn)型。以上結(jié)果表明,SlMPK13在番茄營養(yǎng)生長與生殖發(fā)育過程中的功能具有多效性。
(5)為特異地研究SlMPK13在番茄花粉發(fā)育中的功能,我們構(gòu)建了花粉特異啟動子LAT52啟動的RNAi載體pLAT52∷slmpk13-RNAi。對花
8、粉進(jìn)行表型觀察發(fā)現(xiàn),超過50%的轉(zhuǎn)基因花粉畸形,花粉生活力及萌發(fā)率下降,花粉育性顯著降低,番茄的座果率以及單果種子數(shù)目顯著下降。花粉細(xì)胞學(xué)觀察與DAPI染色結(jié)果顯示,在小孢子發(fā)育的雙核早期及其以前的幾個時期,pLAT52∷ slmpk13-RNAi轉(zhuǎn)基因花粉發(fā)育正常,營養(yǎng)核及生殖核正??梢姟kp核大液泡時期以后,花粉細(xì)胞膜開始呈現(xiàn)不規(guī)則凹陷及破損,液泡數(shù)目增多。隨著花粉成熟,液泡體積變大,細(xì)胞內(nèi)容物逐漸降解,最終形成皺縮干癟的花粉粒。
9、r> (6)利用RNA-seq技術(shù)比較了pLAT52∷slmpk13-RNAi轉(zhuǎn)基因與對照雄蕊在不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雄蕊發(fā)育早期差異表達(dá)基因數(shù)量極少,而雄蕊發(fā)育后期有1077個差異表達(dá)基因,其中846個上調(diào)表達(dá),231個下調(diào)表達(dá)?;虮倔w論(Gene Othology,GO)和生物學(xué)代謝途徑(pathway)分析顯示,大多數(shù)差異表達(dá)基因參與“碳水化合物代謝”、“細(xì)胞元件形成”、“信號傳導(dǎo)”、“細(xì)胞凋亡”等生物學(xué)
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