大豆異黃酮合成途徑基因的進化分析及轉(zhuǎn)錄因子GmMYB184的功能鑒定.pdf

1、異黃酮是苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，主要存在于豆科植物中。異黃酮類次生代謝產(chǎn)物對于植物與微生物的互作非常重要，并且有著重要的醫(yī)療保健作用，因此提高異黃酮含量是大豆品質(zhì)育種的目標之一。但是大豆異黃酮的合成代謝途徑非常復(fù)雜，對單個途徑酶進行修飾的方法難以取得理想效果。蛋白互作的研究加深了我們對大豆異黃酮合成的分子機制的了解，對于轉(zhuǎn)錄因子的研究能夠促進大豆異黃酮或者其他農(nóng)藝性狀的改良，對大豆品質(zhì)的遺傳工程有所幫助。
　　異黃酮的合

2、成起始于苯丙烷代謝的公共途徑，從苯丙氨酸開始，由一系列含有多個拷貝的酶催化，由分支節(jié)點酶導(dǎo)入異黃酮合成的分支途徑，最終形成異黃酮及異黃酮類衍生物。盡管苯丙烷代謝途徑包括其分支異黃酮代謝途徑是目前研究得比較透徹的次生代謝途徑，但是關(guān)于異黃酮代謝途徑基因的分子進化仍然所知甚少，因此，研究關(guān)鍵基因的進化模式，結(jié)合“metabolons”理論的途徑酶互作分析，有助于更透徹地了解異黃酮代謝途徑復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，鑒定一些調(diào)控途徑關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄因子

3、可以進一步了解異黃酮合成調(diào)控的分子機制，為代謝工程和遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。
　　本研究通過對異黃酮代謝途徑基因進行進化模式的分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因經(jīng)歷了相似的選擇模式，并表現(xiàn)出趨同進化，推測這些酶可能形成大分子蛋白復(fù)合物。用酵母雙雜的方法對途徑一部分酶的拷貝組合進行了互作分析，實驗結(jié)果表明IFS能夠與分支節(jié)點酶CHS、CHR互作，CHI能夠與CHS、CHR互作，PAL能夠與C4H互作。這些結(jié)果一定程度證明了這樣的大分子蛋白復(fù)合物存在的

4、可能性。
　　此外，本研究克隆了一個大豆非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GmMYB184并進行了初步的功能驗證。亞細胞定位研究證實了GmMYB184轉(zhuǎn)錄因子的細胞核定位。組織表達分析表明了該轉(zhuǎn)錄因子基因與IFS2的表達模式相同，在根和成熟種子中大量表達，并且隨著種子發(fā)育，表達量上升。同時，GmMYB184和IFS2的表達模式與異黃酮的積累模式相似。谷胱甘肽誘導(dǎo)表達分析表明該轉(zhuǎn)錄因子基因與IFS2共誘導(dǎo)，可能參與相似的生物過程。采用雙熒光

5、素酶報告系統(tǒng)分析其對異黃酮合成途徑關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄激活活性影響，發(fā)現(xiàn)GmMYB184能夠分別促進CHS8和IFS2啟動子表達活性提高5倍和7倍。最后通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，找到該轉(zhuǎn)錄因子在異黃酮合成調(diào)控中的直接作用證據(jù)。沉默GmMYB184導(dǎo)致異黃酮含量的顯著下降，表明GmMYB184轉(zhuǎn)錄因子對于異黃酮的合成過程是必須的。但是，過表達GmMYB184不足以顯著提高毛狀根中異黃酮的含量。
　　總之，本研究從進化選擇、蛋白互作和轉(zhuǎn)