作物缺磷和菌根信號轉導途徑中調控基因的鑒定與功能驗證.pdf

1、磷(Phosphorus，P)是植物生長發(fā)育必需的大量營養(yǎng)元素之一，廣泛地參與到植物體內(nèi)的能量轉移、信號轉導、光合作用等過程。它還是許多生物大分子如核酸、磷脂和含磷蛋白酶類的重要組成部分。然而，由于P在土壤中容易被固定和沉淀，且植物從土壤中吸收的主要是無機態(tài)正磷酸鹽(Phosphate，Pi)，故相對于其他營養(yǎng)元素，P在土壤中的移動性和有效性均很低，其也因此常常成為農(nóng)田及自然生態(tài)系統(tǒng)中植物生長的主要限制因子之一。植物在漫長的進化過程中發(fā)

2、展出了一套適應缺磷環(huán)境的形態(tài)變化及生理生化方面的機制，包括根系構型的改變、酸性磷酸酶、RNA酶及有機酸的分泌、與叢枝菌根真菌(AMF，(A)rbuscular(M)ycorrhizal(F)ungi)形成共生體系等等。
　　 植物對缺磷環(huán)境的這些適應性機制都是由其背后一系列精巧的分子機制作為支撐的。近年來，該研究領域科學家們針對這些分子機制做了大量的研究，初步構建了植物缺磷和菌根共生信號轉導途徑的分子調控網(wǎng)絡。這個網(wǎng)絡中的“節(jié)點

3、”，即基因之間在不同水平存在著復雜的調控或被調控的關系。一個基因在表達豐度或時間空間上的變化可能會造成整個網(wǎng)絡的重新調整。雖然我們對植物缺磷和菌根共生信號轉導途徑這兩個分子調控網(wǎng)絡的認識正不斷深入，發(fā)現(xiàn)了在前者中起中心調控作用并可能連接兩個網(wǎng)絡的關鍵調控因子PHR((PH)osphate Starvation(R)esponse)，但根據(jù)近年來該領域的研究進展來看，欲全面揭開其神秘的面紗仍有諸多工作要做。為了對這兩個網(wǎng)絡進行進一步的補充

4、完善，本研究以鑒定植物中參與到缺磷和菌根共生信號途徑中的微小RNA(microRNA，miRNA)和轉錄因子基因兩方面作為切入點，取得了以下的主要結果:
　　 1.根據(jù)已知植物中所有miRNA的成熟片段序列，與茄科植物煙草的GSS(Genome Survey Sequence)和EST(Expressed Sequence Tag)序列進行比對，繼而由生物信息學技術從煙草中預測到分屬于84個家族共計276個miRNA基因，并分析

5、了全部276個基因的一系列特征參數(shù)。發(fā)現(xiàn)煙草miRNA也是以多基因家族的方式出現(xiàn);其成熟片段和前體結構的長度分別集中在21個堿基和75-114個堿基左右;90％以上miRNA前體的A和U含量之和在50％-70％之間;在不同物種中非常保守的缺磷誘導表達的miR399和miR827在缺磷條件下的煙草中表達也發(fā)生上調。
　　 2.通過miRNA基因芯片結合實驗驗證的方法在茄科植物番茄中鑒定出23個保守的miRNA，發(fā)現(xiàn)其中16個受到磷

6、素營養(yǎng)或菌根共生信號或二者共同的調控。證明了miRNA基因表達的變化也是植物缺磷和菌根共生信號轉導途徑中重要的組成部分，且植物缺磷和菌根共生信號轉導途徑存在部分重疊。
　　 3.采用RT-PCR方法結合生物信息學及組織化學分析研究了水稻中缺磷誘導表達的miRNA基因，osa-miR827a(OsmiR827a)及其靶基因。發(fā)現(xiàn)OsmiR827a受缺磷信號專一性誘導表達，且其成熟片段可能作為長距離運輸信號分子通過韌皮部從地上部轉運

7、到地下部。此外，結果表明雖然miRNA827在不同物種中非常保守，但其對靶基因的調控機制可能在單子葉和雙子葉植物物種分化的過程中發(fā)生了變異。不同于擬南芥AtmiR827的靶基因AtNLA((N)itrogen(L)imitation(A)daptation;屬于SPX家族中的SPX-RING亞家族），水稻OsmiR827a的靶基因屬于SPX家族中的SPX-MFS-1亞家族，且其靶基因有兩個，OsSPX7和OsSPX8。雖然二者的氨基酸序

8、列一致性大于80％、結構高度相似且都定位于細胞質膜上，但對缺磷信號的響應卻完全相反。
　　 4.對OsSXP7和OsSPX8兩個基因各兩個株系的Tosl7轉座子插入突變體(osspx7-1、osspx7-2和osspx8-1、osspx8-2)在不同供磷條件下的表型、有效磷含量等生理指標進行測定后發(fā)現(xiàn)，osspx7-2在高磷和全銨營養(yǎng)且高磷處理下表現(xiàn)出磷中毒的癥狀，其葉片中有效磷濃度在兩種處理下分別為野生型植株的6.2倍和3.8

9、倍，在低磷條件下其葉片中有效磷濃度與野生型植株相比提高了1倍;對于OsSPX8兩個株系的突變體osspx8-1和osspx8-2，只有在高磷和全銨營養(yǎng)且高磷兩種條件下，其葉片中的有效磷含量比野生型植株提高40％左右。此外，通過對突變體中磷酸鹽轉運蛋白(PT，Phosphate Transporter)基因及其它缺磷信號轉導途徑中基因表達的檢測及與其它在正常供磷條件下表現(xiàn)出磷中毒癥狀的突變體或轉基因植株的情況相比較，我們推測OsSXP7和

10、OsSPX8至少部分是通過抑制PT基因表達來實現(xiàn)其在植物體內(nèi)磷的動態(tài)平衡過程中的作用。
　　 5.在水稻缺磷信號轉導途徑中心調控因子基因OsPHR2（(PH)osphate Starvation(R)esponse(2))的過量表達植株中對OsmiR827a的表達豐度進行了檢測，結果表明OsmiR827a可能是新發(fā)現(xiàn)的由OsPHR2直接調控的下游基因。
　　 6.通過將番茄中菌根特異表達PT基因LePT4的啟動子進行分割

11、和定點突變、融合GUS報告基因繼而由根癌農(nóng)桿菌介導的轉基因方法轉入煙草中檢測分析，證明了缺磷信號轉導途徑中的關鍵順式調控元件P1BS((P)HR1 Binding Sequence)對茄科植物中菌根誘導或特異表達的PT基因的轉錄激活是必不可少的。而此轉錄激活過程不需要調控豆科植物血紅蛋白基因在根瘤和菌根組織特異性表達相關的NODCON2GM和參與植物的防御反應的WRKY710S這兩個順式調控元件的參與。
　　 7.根據(jù)擬南芥和水

12、稻中PHR基因的保守序列設計簡并引物，以煙草cDNA為模板進行PCR擴增、測序獲得其保守區(qū)序列后通過RLM-RACE方法獲得了煙草PHR同源基因NtPHR2的cDNA全長序列。氨基酸序列比對和進化樹分析結果表明，NtPHR2與擬南芥AtPHR1和水稻OsPHR2一樣屬于MYB轉錄因子家族中的MYB-CC(Coiled-Coil)亞家族，且與AtPHR1的親緣關系最近。
　　 8.通過基因槍轟擊洋蔥表皮、RT-PCR和酵母雙雜交系