乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白的篩選及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究.pdf

1、摘要摘要乳腺癌是女性最普遍的惡性腫瘤，乳腺癌轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因，目前乳腺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)理尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期將人乳腺癌MCF一7細(xì)胞皮下接種SCID鼠，從轉(zhuǎn)移臟器中成功獲得了具有高轉(zhuǎn)移傾向的人乳腺癌LM一MCF一7細(xì)胞系(己獲得國(guó)家發(fā)明專利，ZL.031310264.5)。為進(jìn)一步探討LM一MCF一7細(xì)胞高轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，闡明乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)理，本研究應(yīng)用具有不同轉(zhuǎn)移能力的MCF一7幾M一MCF一7細(xì)胞模型，篩選了乳腺癌轉(zhuǎn)移

2、相關(guān)的基因和蛋白，并對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的增殖和遷移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行了深入研究，主要研究?jī)?nèi)容如下:一、篩選乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白應(yīng)用基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較了MCF一7和LM一MCF一7細(xì)胞中基因和蛋白表達(dá)譜的變化。基因芯片共篩選出差異表達(dá)基因121個(gè)，其中78個(gè)在LM.MCF一7細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，43個(gè)表達(dá)下調(diào)。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量又1飛PCR對(duì)其中7個(gè)基因進(jìn)行了驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果與芯片一致蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)初步發(fā)現(xiàn)9個(gè)差異顯著的蛋白。應(yīng)用認(rèn)怡st

3、emblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MLCK、Survivin和Bcl一2在LM一MCF一7細(xì)胞中高表達(dá)，而nm23和p27低表達(dá)。差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)的功能廣泛涉及到細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞茹附與轉(zhuǎn)移和代謝等多個(gè)方面。二、LM一MCF一7細(xì)胞高增殖和遷移能力及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究1.MCF一7和LM一MCF一7細(xì)胞增殖和遷移能力的比較流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示LM一MCF一7細(xì)胞的增殖指數(shù)為6076，高于MCF一7細(xì)胞的36月9，BrdU摻入實(shí)驗(yàn)也得到

4、同樣結(jié)果軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，LM一MCF一7細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化能力高于MCF一7細(xì)胞瓊脂糖滴細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Boyden小室跨膜遷移等實(shí)驗(yàn)顯示，LM一MCF一7細(xì)胞比MCF一7細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力。2.MAPK信號(hào)途徑與LM一McF一7細(xì)胞高增殖和遷移的關(guān)系我們從基因芯片檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，LNI一MCF一7細(xì)胞中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)因子MAP7、FOS等基因高表達(dá)，提示MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，本研究應(yīng)

5、用Westemblot檢測(cè)了MCF一7細(xì)胞和LM一MCF一7細(xì)摘要謝與LM一MCF一7細(xì)胞高增殖和遷移的關(guān)系。認(rèn)怡Stemblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與AA釋放有關(guān)的cPLAZ抑制劑(AACOCF3)及AA代謝酶COX一2抑制劑(Indo)和LOX抑制劑(NDGA)可明顯下調(diào)LM一MCF一7細(xì)胞中p一EIUKI2的表達(dá)。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)和Boyden小室跨膜遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ind。和NDGA可抑制LM一McF一7細(xì)胞的增殖和遷移。應(yīng)用外源2印M

6、AA直接作用McF一7細(xì)胞，可明顯促進(jìn)p一ERKI2的表達(dá)，并被Ind。、NDGA和PTX明顯抑制。以上結(jié)果表明，AA經(jīng)COX和LOX的代謝產(chǎn)物可能通過(guò)作用Gio蛋白激活下游相關(guān)信號(hào)途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。AA及其代謝產(chǎn)物均為脂類分子，可以分泌到細(xì)胞外。我們推測(cè)AA代謝產(chǎn)物除了可以促進(jìn)LM一MCF一7細(xì)胞自身的增殖和遷移外，還可以對(duì)鄰近癌旁細(xì)胞發(fā)揮作用。于是我們用LM一MCF一7細(xì)胞的條件培養(yǎng)液作用MCF一7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可濃度依賴

7、的促進(jìn)MCF一7細(xì)胞中p一ERKI2的表達(dá)，并且可促進(jìn)McF一7細(xì)胞的增殖能力，該作用也能被PTX抑制。上述結(jié)果證實(shí)了我們的假設(shè)。三、高轉(zhuǎn)移乳腺癌MDA一入IB一231細(xì)胞中細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)信號(hào)途徑的研究為證實(shí)上述發(fā)現(xiàn)的乳腺癌細(xì)胞高增殖和遷移相關(guān)信號(hào)途徑的普遍性，我們應(yīng)用了國(guó)內(nèi)外研究較多的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDA一MB一231與MCF一7細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)p一ERKI2、p一catenin、cyclinDI、survivin、cPLA

8、Z和cOX一2等在MDA一MB一231細(xì)胞中也高表達(dá)，并可被PD98059抑制，cPLAZ、COX、LOX和Gio蛋白的抑制劑均可下調(diào)p一ER長(zhǎng)12的高表達(dá)。MDA一MB一23工細(xì)胞的條件培養(yǎng)液也可上調(diào)MCF一7細(xì)胞中p一ERKI2的表達(dá)，并受到p1X的抑制。上述結(jié)果提示MDA一MB一231細(xì)胞的增殖和遷移信號(hào)途徑與LM一MCF一7細(xì)胞相似。綜上所述，我們應(yīng)用基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)等方法，在具有高低不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞系中篩選出與乳腺

9、癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)基因和蛋白，為進(jìn)一步研究高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系的增殖和遷移相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了信息和思路。本研究發(fā)現(xiàn)了高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系的高增殖和遷移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與壓oPLCPKCERKI2MLCK幣一MLC和ERKI2p一cateni可cyclinDI和Survivin等有關(guān)，人A的COX和LOX的代謝產(chǎn)物可激活該信號(hào)途徑。上述研究進(jìn)一步闡明了孚L腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為乳腺癌轉(zhuǎn)移的早期診斷、預(yù)防和治療奠定了理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:乳腺癌轉(zhuǎn)移E