細(xì)菌表達(dá)dsRNA和寄主表達(dá)hairpin dsRNA介導(dǎo)的玉米黏蟲chitinase基因的RNA干擾研究.pdf

1、玉米黏蟲（Mythimna separata）屬于鱗翅目夜蛾科，是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，嚴(yán)重暴發(fā)時(shí)會(huì)造成農(nóng)作物大面積減產(chǎn)甚至絕收。
　　RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指生物體內(nèi)源或者外源的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介導(dǎo)產(chǎn)生特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象。RNAi除了在模式昆蟲如果蠅（D.melanogaster）中得到廣泛應(yīng)用以外，在非模式昆蟲中也得到了成功的應(yīng)用。進(jìn)一

2、步研究發(fā)現(xiàn)，RNA干擾技術(shù)與第二代測序技術(shù)相結(jié)合，可以快速找到非模式昆蟲的致死效應(yīng)的靶基因序列，加快了利用RNAi技術(shù)控制害蟲的步伐。
　　本研究以玉米黏蟲幾丁質(zhì)酶編碼基因（chitinase）為候選基因，分別設(shè)計(jì)合成了chitinase1和chitinase2基因RNA干擾序列，為了達(dá)到RNA干擾效應(yīng)，我們設(shè)計(jì)了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)方案。第一，采用了細(xì)菌表達(dá)dsRNA的RNA干擾系統(tǒng)（即大腸桿菌HT115和L4440載體）對靶基因進(jìn)行了RN

3、A干擾。根據(jù)L4440載體的兩端各有一個(gè)T7啟動(dòng)子的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了針對玉米黏蟲幾丁質(zhì)酶（chitinase）基因的RNA干擾載體，將構(gòu)建成功的重組載體導(dǎo)入大腸桿菌HT115感受態(tài)細(xì)胞中。在IPTG誘導(dǎo)下，成功獲得了靶標(biāo)基因（chitinae1和chitinae2）所對應(yīng)的dsRNA。誘導(dǎo)產(chǎn)生的dsRNA經(jīng)純化后，混合人工飼料飼喂玉米黏蟲幼蟲。持續(xù)飼喂七天后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定玉米黏蟲編碼幾丁質(zhì)酶（chitinase）基因的m

4、RNA表達(dá)量。結(jié)果表明，chitinase1和chitinase2基因的表達(dá)量相比于對照組均有明顯降低的現(xiàn)象，顯示目的基因的表達(dá)受到了特異性的抑制。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，對chitinase1、chitinase2基因的特異的干擾也引起了玉米黏蟲的體重減少和死亡率增加的現(xiàn)象。第二，將上述chitinase1和chitinase2基因片段以hairpin dsRNA的形式在植物中表達(dá)，深入研究利用RNA干擾技術(shù)培養(yǎng)抗玉米黏蟲的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。利用Gat