核纖層蛋白的生物信息分析及下調(diào)lmna對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)rag-1基因表達(dá)影響的初步研究.pdf

1、目的：利用斑馬魚(yú)作為模式生物，進(jìn)行l(wèi)mna基因的生物信息分析，并利用morpholino逆向遺傳學(xué)技術(shù)下調(diào)lmna基因，研究斑馬魚(yú)lmna基因下調(diào)后淋系轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子rag-1的表達(dá)情況，以初步探討lmna基因?qū)α芟翟煅l(fā)育的影響。
　　方法：采用進(jìn)化樹(shù)、蛋白質(zhì)序列比對(duì)及共線性分析方法進(jìn)行斑馬魚(yú)lmna基因的生物信息分析。利用western blot檢測(cè)斑馬魚(yú)體內(nèi)LMNA蛋白的表達(dá)。利用lmna-pCS2+（full-length）

2、和EGFP-pCS2+質(zhì)粒構(gòu)建lmna-EGFP-pCS2+質(zhì)粒，通過(guò)測(cè)序鑒定驗(yàn)證質(zhì)粒克隆成功。將質(zhì)粒顯微注射于胚胎中，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。將質(zhì)粒與lmna-morpholino共注射，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。若綠色熒光下降或消失，即lmna-morpholino能有效下調(diào)lmna基因，建立lmna基因下調(diào)的表型。將lmna-morpholino注射組作為實(shí)驗(yàn)組，control-morpholino注射組作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，顯微注射后

3、收集相應(yīng)時(shí)相的胚胎，通過(guò)原位雜交及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法觀察淋系轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子rag-1基因的表達(dá)情況，研究lmna基因下調(diào)后，對(duì)淋系轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子rag-1的影響。
　　結(jié)果：生物信息分析結(jié)果提示斑馬魚(yú)的lmna、lmnb1和lmnb2基因是人類lmna、lmnb1和lmnb2基因的直向同源物。Western blot法成功檢測(cè)斑馬魚(yú)體內(nèi)LMNA蛋白的表達(dá)，第一個(gè)條帶大小為69KD，第二個(gè)條帶大小為62KD。在基因水平上驗(yàn)證lmna

4、-morpholino能有效下調(diào)lmna基因，即同時(shí)注射lmna-EGFP-pCS2+質(zhì)粒和lmna-morpholino后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光消失。原位雜交及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法結(jié)果提示，rag-1基因在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)有下降。
　　結(jié)論：1.斑馬魚(yú)的核纖層蛋白與人類的相似程度高，具有直向同源性，提示基因在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。2.斑馬魚(yú)體內(nèi)可檢測(cè)到lmna基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。3.構(gòu)建lmna-EGFP-pCS2+質(zhì)粒用于