“綠色”胰島β細(xì)胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚及應(yīng)用.pdf

1、目的： 本課題旨在使用轉(zhuǎn)基因和綠色熒光蛋白示蹤技術(shù)，建立活體 “綠色”胰島β細(xì)胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型；在此基礎(chǔ)上初步探索結(jié)合化學(xué)遺傳學(xué)方法靶向清除破壞胰島β細(xì)胞。胰島β細(xì)胞破壞模型的建立為活體高通量篩選胰島β細(xì)胞再生的小分子化合物和中草藥奠定了研究基礎(chǔ)。 方法: 利用分子克隆和顯微注射方法建立綠色熒光蛋白標(biāo)記的胰島β細(xì)胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚系；PCR技術(shù)、全胚胎原位雜交和活體成像技術(shù)，從DNA，RNA和蛋白質(zhì)三個(gè)水平證實(shí)GFP的表

2、達(dá)可以特異性反映內(nèi)源性胰島素的表達(dá)情況；遺傳學(xué)方法進(jìn)一步建立胰島β細(xì)胞破壞的活體轉(zhuǎn)基因斑馬魚動(dòng)物模型。 結(jié)果: 1、用酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒p-IsceI-INS:nfsB-GFP進(jìn)行顯微注射，建立胰島β細(xì)胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。 2、熒光篩選獲得生殖系穩(wěn)定遺傳的F1代胰島β細(xì)胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚。PCR、全胚胎原位雜交和活體成像分別從DNA，RNA和蛋白質(zhì)三個(gè)不同的水平證實(shí)外源性基因INS:nfsB-GFP整合進(jìn)入斑馬魚

3、基因組。 3、連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測活體斑馬魚胰島β細(xì)胞發(fā)育情況。從受精后24h脊索中線位置上單個(gè)細(xì)胞層的厚度到受精后48小時(shí)胰島β細(xì)胞由中線向右遷移，形成不對稱的分布。受精后的120小時(shí)，胰島β細(xì)胞最終形成了一個(gè)右位器官。 4、10mM甲硝唑與轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎共同孵育48小時(shí)，nfsB蛋白將無毒性的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒素，在活體直接破壞胰島β細(xì)胞。 結(jié)論: 1、通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，建立活體可視化“綠色”胰島β細(xì)胞發(fā)