應(yīng)用轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究miRNA參與心肌肥厚和維生素影響血管新生的功能與機(jī)制.pdf

1、斑馬魚是目前研究器官發(fā)育和疾病發(fā)生的常見模式動(dòng)物之一，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，具有以下優(yōu)點(diǎn):1）體外受精、胚胎透明，易于進(jìn)行胚胎和遺傳學(xué)操作;2）發(fā)育快速、性成熟周期短、產(chǎn)卵量大;3）基因組序列的測(cè)序基本完成，與人類高度保守。在心血管系統(tǒng)疾病的研究中，斑馬魚被廣泛應(yīng)用，一方面可以通過基因操作技術(shù)探討特定基因在心血管發(fā)育和疾病發(fā)生中的作用;另一方面，斑馬魚可以作為大規(guī)?；钚晕镔|(zhì)的篩選平臺(tái)。本課題利用斑馬魚作為模式動(dòng)物，從這兩方面

2、探討斑馬魚在心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生和活性物質(zhì)篩選中的應(yīng)用。1）MicroRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類通過抑制轉(zhuǎn)錄對(duì)靶基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控的小分子非編碼RNA。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miRNA在心肌肥厚的病理生理過程中表達(dá)異常，并對(duì)心肌肥厚起促進(jìn)或抑制作用。本課題通過建立心臟特異的miRNA轉(zhuǎn)基因斑馬魚平臺(tái)來評(píng)估m(xù)iRNA在心肌肥厚中的作用。2）維生素作為微量物質(zhì)在各種生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)某些藥物劑量的維生素對(duì)心

3、血管的發(fā)育具有影響。本課題通過建立小分子活性物質(zhì)功能斑馬魚篩選平臺(tái)來篩選維生素對(duì)于血管發(fā)育的影響。
　　 第一部分利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚平臺(tái)評(píng)估m(xù)iR-22和miR-24對(duì)心肌肥厚的影響
　　 心肌肥厚是一種對(duì)于心臟超負(fù)荷工作的適應(yīng)性反應(yīng)，是導(dǎo)致慢性心衰的重要原因之一。MiRNAs在這一病理過程中的作用機(jī)制成為近幾年研究的熱點(diǎn)之一。
　　 一、目的:利用心肌細(xì)胞特異轉(zhuǎn)基因斑馬魚平臺(tái)評(píng)估m(xù)iR-22和miR-24在心肌肥

4、厚中的作用，并探索心肌細(xì)胞特異轉(zhuǎn)基因斑馬魚在心肌肥厚研究中的應(yīng)用。
　　 二、方法:
　　 1、心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及肥大模型的建立
　　 取出生2天的SD乳鼠心室，用D-Hanks洗滌心臟，將心室剪成1mm3左右的組織碎塊，胰酶消化后收集細(xì)胞，并細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于12孔板培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)48小時(shí)后，進(jìn)行無血清培養(yǎng)24小時(shí)。然后以10uM的苯腎上腺素或5uM的血管緊張素Ⅱ刺激細(xì)胞48小時(shí)后，進(jìn)行細(xì)胞表型觀察

5、和RNA、蛋白分析。
　　 2、細(xì)胞免疫熒光染色
　　 將心肌細(xì)胞接種于載玻片上，4％多聚甲醛固定20rnin，PBS清洗3次，每次15min。10％BSA封閉10min后，稀釋好的α-actinin抗體室溫孵育12h，用含0.1％吐溫20的PBS室溫洗三次，每次10min。用熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光溫育2min，用含0.1％的吐溫20的PBS室溫洗三次，每次10min，熒光顯微鏡下觀察攝像。
　　 3、過表達(dá)m

6、iRNA的腺病毒載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
　　 將miRNAs前體序列PCR擴(kuò)增后克隆至pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒。穿梭質(zhì)粒經(jīng)酶切線性化后，電轉(zhuǎn)B J5183感受態(tài)菌，以獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒線性化后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞變圓或成葡萄串珠狀時(shí)，棄上清，凍融細(xì)胞，獲得第一代病毒。按10ifu的滴度轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，待其變圓后，將其從培養(yǎng)瓶底吹下，離心棄上清，重懸細(xì)胞，反復(fù)凍融三次。離心棄沉淀，上清經(jīng)CsCl密度梯度

7、離心獲得較高滴度的病毒液，10倍梯度稀釋后，轉(zhuǎn)染293T，觀察綠色熒光確定病毒滴度。
　　 腺病毒以50MoI、100MoI滴度轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)綠色熒光細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，以確定轉(zhuǎn)染效率;通過定量PCR和Northern blot檢測(cè)miRNA表達(dá)量以確定病毒的表達(dá)效率。
　　 4、MiRNA反義序列的設(shè)計(jì)及沉默效率分析
　　 Mirbase獲得miRNAs成熟序列，設(shè)計(jì)其反義互補(bǔ)序列，進(jìn)行堿基的2'甲氧

8、修飾，化學(xué)合成。將siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，孵育48小時(shí)，RNA抽提，定量PCR和Northern blot檢測(cè)，確定其對(duì)miR-22及miR-24的沉默效率。
　　 5、斑馬魚心臟特異轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 將miRNAs前體序列PCR擴(kuò)增后連接至pMD-18T載體。然后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中并培養(yǎng)搖菌后抽提質(zhì)粒。用NcoI和EcoRI酶切重組質(zhì)粒及pTol2-CMLC2-IRES-EGFP轉(zhuǎn)基因載體，然后將

9、miRNA前體片段在T4 DNA連接酶作用下連接酶切后的1o12質(zhì)粒，后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定和基因測(cè)序。
　　 6、MiRNA心肌特異轉(zhuǎn)基因斑馬魚系的構(gòu)建
　　 將配制好注射用的重組轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座酶mRNA加入顯微注射針。將剛產(chǎn)下的斑馬魚卵轉(zhuǎn)移至瓊脂糖平板內(nèi)的凹槽中，并將多余的水分吸走同時(shí)又要避免魚卵過于干燥。調(diào)節(jié)顯微注射儀上的調(diào)節(jié)鈕設(shè)置注射的時(shí)間、壓力等指標(biāo)。一般以單細(xì)胞期胚胎進(jìn)行注

10、射效果最佳，每枚魚卵被注射的量大約為4nL。注射完成后，將胚胎輕輕移至孵化水中放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胚胎發(fā)育到48小時(shí)，體視熒光顯微鏡下，觀察綠色熒光在斑馬魚心臟部位的表達(dá)，并挑選陽性胚胎進(jìn)行飼養(yǎng)，成年后雜交及胚胎篩選。
　　 三、結(jié)果:
　　 1、心肌細(xì)胞肥大模型的建立
　　 心肌細(xì)胞培養(yǎng)2天后聚集成簇，并出現(xiàn)同步化搏動(dòng)，在苯腎上腺素及血管緊張素Ⅱ的誘導(dǎo)下收縮蛋白合成增多，心肌細(xì)胞表面積增大。顯微鏡下觀察對(duì)照組心肌

11、細(xì)胞呈較小的三角形;苯腎上腺素或血管緊張素Ⅱ處理組心肌細(xì)胞呈飽滿三角形或圓形，且細(xì)胞明顯肥大。
　　 2、過表達(dá)和抑制miR-22對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響
　　 通過大鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-22模擬物來實(shí)現(xiàn)miR-22的過表達(dá)。MiR-22模擬物轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞48小時(shí)后，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR分析miR-22的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-22的表達(dá)量明顯升高。與對(duì)照組相比轉(zhuǎn)染了miR-22模擬物的心肌細(xì)胞明顯增大。利用miR-22抑制物實(shí)

12、現(xiàn)內(nèi)源性miR-22表達(dá)的下調(diào)。MiR-22抑制物被轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞48小時(shí)后，通過實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性miR-22明顯下降。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞表面積明顯降低，表明miR-22的降低抑制苯腎上腺素及血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。
　　 3、抑制miR-24對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響
　　 利用miR-24抑制物轉(zhuǎn)染苯腎上腺素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性miR-24表達(dá)的下調(diào)。MiR-24抑制

13、物被轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞48小時(shí)后，實(shí)時(shí)定量PCR分析表明內(nèi)源性miR-24明顯下降。通過免疫熒光和表面積測(cè)量實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞表面積明顯降低，表明miR-24的降低能夠抑制苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。
　　 4、成功構(gòu)建心肌特異miRNA轉(zhuǎn)基因斑馬魚平臺(tái)
　　 通過質(zhì)粒重組技術(shù)構(gòu)建了包含miR-22和miR-24的pToI2-CMLC2-miRNA-IRES-EGFP斑馬魚轉(zhuǎn)基因載體，并且經(jīng)過酶切鑒定以及

14、基因測(cè)序后證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將miR-22和miR-24轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座酶mRNA分別顯微注射入單細(xì)胞期斑馬魚胚胎，胚胎發(fā)育48小時(shí)后體視熒光顯微鏡下觀察到斑馬魚心肌組織出現(xiàn)綠色熒光。陽性斑馬魚胚胎飼養(yǎng)成年后，其子代胚胎觀察到心肌組織中表達(dá)綠色熒光蛋白，表明心肌特異miRNA轉(zhuǎn)基因斑馬魚系構(gòu)建成功。目前miR-22和miR-24在心肌肥厚中的功能在該轉(zhuǎn)基因斑馬魚模式動(dòng)物中做進(jìn)一步研究。
　　 四、結(jié)論:
　　 1、M

15、iR-22在心肌細(xì)胞中過表達(dá)，能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。
　　 2、MiR-22和miR-24的降低抑制苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。
　　 3、成功構(gòu)建心肌特異miRNA轉(zhuǎn)基因斑馬魚平臺(tái)，并可以此為平臺(tái)研究miRNA對(duì)心臟功能的影響。
　　 第二部分利用血管內(nèi)皮特異綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究維生素對(duì)于血管新生的影響
　　 轉(zhuǎn)基因斑馬魚的另一個(gè)重要應(yīng)用是可進(jìn)行大規(guī)模的小分子活性物質(zhì)篩選。維生素是維持正常生理

16、功能所必需的一類微量物質(zhì)，在人體生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道維生素對(duì)于血管新生具有促進(jìn)或者抑制作用。本部分利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚在體水平篩選影響血管發(fā)育和新生的維生素。
　　 一、目的:利用內(nèi)皮細(xì)胞特異轉(zhuǎn)基因斑馬魚平臺(tái)評(píng)估維生素對(duì)于血管發(fā)育和新生的影響。
　　 二、方法:
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 內(nèi)皮細(xì)胞特異轉(zhuǎn)基因斑馬魚系Tg(flkl:EGFP)在斑馬魚培養(yǎng)系統(tǒng)中培育，3個(gè)月后開始

17、馴化產(chǎn)卵。
　　 2、魚卵收集
　　 實(shí)驗(yàn)前一天下午，將斑馬魚雄魚與雌魚按照1∶1比例放入產(chǎn)卵槽中，在產(chǎn)卵槽底部放置網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)卵槽中間放置隔板。然后將放入斑馬魚的產(chǎn)卵槽蓋布避光。第二日揭開遮光布、拿掉隔板，讓雌魚與雄魚交配。受精卵形成后10分鐘內(nèi)將胚胎收集于培養(yǎng)皿內(nèi)，放置于智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)孵化2小時(shí)。
　　 3、不同濃度維生素的配制
　　 根據(jù)Westerfield方案配制魚卵水(egg water，1

18、37 mmol/L NaC1，5.4 mmol/L KC1，0.13 mmol/L Ca2Cl，0.1 mmol/L Mg2+，pH7.2)，將不同的維生素溶入二甲亞砜(DMSO)終濃度為0.5％的魚卵水中，配制成不同濃度。
　　 4、斑馬魚魚卵處理
　　 將2hpf斑馬魚胚胎放入24孔板，每孔中至少20個(gè)胚胎，加入不同濃度的各種維生素，形成藥物的不同濃度梯度。實(shí)驗(yàn)組每孔加入上述不同濃度維生素3 ml，對(duì)照組每孔加入含0

19、.5％ DMSO的魚卵水。從受精卵形成后2h開始刺激，持續(xù)20 h后觀察斑馬魚節(jié)間血管的發(fā)育情況。
　　 5、藥物效應(yīng)的評(píng)估
　　 不同濃度的維生素處理20小時(shí)后，將斑馬魚卵剝殼然后4％多聚甲醛固定，然后在熒光顯微鏡下觀察節(jié)間血管的變化，并測(cè)量節(jié)間血管的長度。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少三次，計(jì)算節(jié)間血管的平均長度，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS14.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

20、表示。采用t檢驗(yàn)計(jì)算組間差異，P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、結(jié)果:
　　 1、不同濃度的維生素K1對(duì)斑馬魚血管發(fā)育的影響
　　 為了研究維生素K1對(duì)于血管發(fā)育的影響，將維生素K1的配制成3種不同濃度:12.5ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml，使用不同濃度的維生素K1浸泡2 hpf的斑馬魚胚胎20小時(shí)后，熒光顯微鏡下觀察斑馬魚節(jié)間血管的發(fā)育并測(cè)量其長度。維生素KI處理后斑馬魚節(jié)間血管

21、平均長度按維生素KI濃度由低到高分別為28.820±8.426μm、26.009±13.083μm、23.433±13.607μm，對(duì)照組斑馬魚節(jié)間血管平均長度為40.718±3.954μm。維生素K1處理組與對(duì)照相比節(jié)間血管長度明顯減少，且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且隨著維生素K1濃度的升高斑馬魚節(jié)間血管長度隨之降低。
　　 2、維生素C、B1和B6對(duì)斑馬魚血管發(fā)育的影響
　　 為了研究這三種維生素對(duì)于血管發(fā)育的影響，將維

22、生素C配制成3種濃度:250ng/ml、500 ng/ml、1000 ng/ml，將維生素B1和B6配制成3種濃度為:25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml。將這些不同濃度的維生素分別處理斑馬魚胚胎20小時(shí)后，熒光顯微鏡下觀察節(jié)間血管的發(fā)育并測(cè)量其長度。結(jié)果顯示維生素C、B1和B6處理后的斑馬魚節(jié)間血管的長度與對(duì)照組相比無明顯差異。
　　 四、結(jié)論:
　　 1、維生素K1抑制血管新生。
　　 2、