基于轉基因斑馬魚抗血管生成中藥活性成分篩選及其作用機制研究.pdf

1、課題背景:隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和生活水平的提高，疾病譜也發(fā)生了改變。感染性疾病負擔減輕，而包括惡性腫瘤在內的慢性非感染性疾病和傷害逐漸成為發(fā)達國家和發(fā)展中國家的疾病主要負擔。據(jù)中國腫瘤登記中心所提供資料顯示:我國惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年增加，我國城市居民主要疾病死亡率位居首位的是惡性腫瘤，惡性腫瘤已成為嚴重威脅我國居民健康的疾病之一。
　　 目前，手術、化療、放療是臨床上治療腫瘤的基本方法，但副作用嚴重，療效欠佳，預后差且價格

2、昂貴。因此，研制開發(fā)防治腫瘤的藥物已成為當今醫(yī)學界的熱點問題。
　　 隨著對腫瘤研究的深入，發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤的生長和腫瘤細胞的轉移均依賴于新生血管的長入，來為腫瘤的增長提供充足的營養(yǎng)。腫瘤新生血管的形成是以血管生成的方式發(fā)生的，若能夠抑制腫瘤組織的血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應，勢必可以達到抑制腫瘤生長和轉移的目的，因此，“抗血管生成療法”或“饑餓療法”很快被提出并成為一種治療腫瘤的新方法。近年來，一些體外研究實驗均顯示，抑制腫瘤細胞

3、新生血管的形成，可達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。2004年FDA批準抗血管生成藥物貝伐單抗，用于治療結直腸癌，可有效的延長病人的生存期。這些研究均證實抗血管生療法治療腫瘤的科學性和有效性。
　　 血管生成是一個受眾多生長因子調節(jié)的復雜的生理、病理過程，在這些生長因子中，VEGF是目前已知作用最強、專屬性最高的促血管生長因子，它能夠增加血管通透性，促進腫瘤血管形成，對腫瘤血管內皮細胞的增殖和遷移發(fā)揮重要作用，以VEGF及其受體作用途

4、徑中的任一環(huán)節(jié)為靶點，阻斷VEGF對腫瘤血管的作用，都可以達到遏制腫瘤生長和轉移的目的，所以，VEGF及其受體是研究血管生成抑制劑作用機制的基本靶點。
　　 中醫(yī)中藥治療疾病（包括腫瘤）有上千年的歷史，積累了豐富的臨床資料，而且我國中藥資源廣博，因此，從天然藥物尤其是傳統(tǒng)中藥中尋找安全有效的腫瘤血管生成抑制劑是新藥研發(fā)領域的重要課題和全新方向。
　　 近年來，斑馬魚因具有養(yǎng)殖和繁殖容易、胚胎發(fā)育迅速等生物學特點，逐漸被用

5、于篩選抗血管生成藥物，其具有以下獨特的優(yōu)勢:①高通量（相對于其他體內試驗）、操作簡單。②篩選周期短。斑馬魚的胚胎發(fā)育速度快，24-72小時即可得到試驗結果。③胚胎透明、易觀察。斑馬魚的胚胎是透明的，很容易觀察其活體狀態(tài)下器官發(fā)育、血管生成情況。④樣品用量少，且為活體動物實驗。⑤用藥簡單。待測化合物可以直接溶于水中并擴散到胚胎中，也可直接注射到胚胎。⑥與人類具有高度相關性，篩選準確率高。⑦成本低。斑馬魚的飼養(yǎng)、繁殖成本遠低于其他實驗動物。

6、
　　 近年來有研究表明:人參皂苷Rg3、姜黃素、去甲斑蝥素、羥基紅花黃色素A、青蒿琥酯、靛玉紅具有抗血管生成的作用。這些中藥活性成分除斑馬魚模型外在其它模型上證實有抗血管生成作用，考慮到在斑馬魚模型上其發(fā)生抗血管生成效果的可能性更大，因此選用了這六種中藥活性成分。本研究以轉基因斑馬魚胚胎為動物模型，利用體視熒光顯微鏡觀察中藥活性成分對其體節(jié)間血管生成抑制效果，從分子生物學角度初步研究抗血管生成機制，同時為斑馬魚抗血管生成中藥活

7、性成分篩選的適用性和可行性提供實驗依據(jù)。
　　 實驗方法:
　　 1、選用帶有血管內皮細胞或者其前體細胞的特異性標記物fli1的轉基因斑馬魚(tgfli1∶eGFP)為篩選藥物的實驗動物。篩選前一天，挑選tgfli1∶ eGFP轉基因斑馬魚純合子和AB野生型斑馬魚放于交配盒中，第二天早晨光照刺激產(chǎn)卵，收集半小時內的胚胎放于盛有胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置于28.5℃孵化箱培養(yǎng)。當胚胎發(fā)育至10hpf時轉移至盛有胚胎培養(yǎng)液的2

8、4孔板中，每個孔放入10個胚胎備用。胚胎發(fā)育至12hpf時，將配置好的藥液依次加入24孔板中。每種藥液分高、中、低個三個濃度。選擇初步有抑制血管生成效果的藥液及其濃度，每種藥液濃度平行5個孔重復實驗。于同一培養(yǎng)板中，留出2列孔，1列加陽性對照藥物(SU5416)，1列不予加藥，1列DMSO組。中藥活性成分均用二甲基亞砜(DMSO)溶解。胚胎發(fā)育至48hpf,用OLYMPUS MVX10體式熒光顯微鏡觀察。挑選抗血管生成有效中藥的胚胎指標

9、如下:與同時期野生型AB斑馬魚胚胎相比大體形態(tài)發(fā)育正常;fli1基因熒光表達強度減弱、缺失或者血管熒光分布紊亂等熒光表達異常的胚胎。
　　 2、針對篩選有效的目標單體，進行初步機制研究。首先利用整體原位雜交(WISH)的方法，初步預測（定性）其flk1 mRNA的表達情況，實驗設計分正常組和試驗組，收集48hpf斑馬魚胚胎（方法同前），體視熒光顯微鏡觀察拍照。然后利用反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的方法，定量分析其flk

10、1 mRNA表達規(guī)律，實驗設計分處理組和空白對照組，收集48hpf斑馬魚胚胎（方法同前）。PCR產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠成像系統(tǒng)捕獲圖像，利用BandScan5.0軟件獲得具體數(shù)據(jù)。
　　 3、實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)、標準差表示。多個樣本均數(shù)間的比較用單因素方差分析。使用One-Way ANOVA分析后，若方差不齊，使用近似F檢驗的Welch法和Brown-Forsythe法，然后運用基于方差不齊的多重比較方法Dunne

11、t'ts T3和Dunnet'ts C。以上數(shù)據(jù)均用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析。顯著性水平P＜0.01。
　　 主要結果:
　　 1、中藥活性成分篩選結果：(1)人參皂苷Rg3、姜黃素無明顯抑制血管生成效果，其中人參皂苷Rg3濃度0.02～0.16μg/μl時，斑馬魚均于24hpf死亡，姜黃素0.016～0.064μg/μl時，每組中有8條斑馬魚死亡。但二者小于死亡濃度時，對血管亦無抑制作用。(2)去甲斑蝥素，未觀察到

12、抑制血管效果，一定濃度對斑馬魚有毒性，濃度在0.025μg/μl就會發(fā)生死亡。(3)羥基紅花黃色素A，當濃度達到8μg/μl～10μg/μl，魚尚未發(fā)生死亡(48hpf)，但脊柱有輕度彎曲，多次重復實驗，僅觀察到有一條魚血管比較清晰，仔細觀察，抑制血管不明顯。所以效果甚微。(4)青蒿琥酯:0.5～1μg/μl時，斑馬魚在28hpf均死亡，0.01、0.05、0.1在72hpf均未破膜，手動破膜后，斑馬魚脊柱屈曲，血管有抑制，但不顯著，且

13、有死亡跡象。(5)靛玉紅，100μM時，魚胚胎出現(xiàn)畸形死亡，15、30、90μM，其抑制血管的程度逐漸加重，但其發(fā)育正常，10條斑馬魚中有8條發(fā)生不同程度的抑制血管作用。
　　 2、青蒿琥酯對斑馬魚體節(jié)間血管生成的觀察二甲基亞砜組與空白對照組相比，體節(jié)間血管長度無差異;與空白對照組相比，青蒿琥酯各劑量組有差異，但并不顯著，未顯示劑量依賴性。
　　 3、靛玉紅對斑馬魚胚胎體節(jié)間血管生成的觀察二甲基亞砜組與空白對照組相比，體

14、節(jié)間血管長度無差異;與空白對照組相比，靛玉紅各劑量組體節(jié)間血管長度有顯著性差異，且呈劑量依賴性抑制。
　　 4、青蒿琥酯對tgfli1∶ eGFP斑馬魚胚胎flk1基因表達的影響與空白對照組相比，青蒿琥酯處理組的基因信號減少，但不顯著;與空白對照組比，青蒿琥酯低劑量組無顯著差異，青蒿琥酯中、高劑量組有顯著差異。
　　 5、靛玉紅對tgfli1∶ eGFP斑馬魚胚胎flk1基因表達的影響與空白對照組相比，靛玉紅處理組的基因

15、信號顯著減少;靛玉紅對斑馬魚胚胎的flk1mRNA的表達水平有明顯的抑制作用，并隨濃度的增高而增加，與空白對照組相比，有顯著性差異。
　　 結論:
　　 1、斑馬魚具有體積小、胚胎透明、繁殖速度快等優(yōu)勢。本研究選用的tgfli1∶eGFP斑馬魚是將GFP（綠色熒光蛋白）標記插入到fli1基因的啟動子序列中，得到了在血管內皮細胞表面表達GFP的轉基因斑馬魚，在熒光顯微鏡下就可以清晰地觀察和定量分析藥物對血管生成的影響。研究

16、表明，此模型較人臍靜脈內皮細胞、雞胚尿囊膜模型更簡便易行，適用于中藥抗血管生成活性成分篩選。
　　 2、六種中藥活性成分抗血管生成觀察結果提示:除青蒿琥酯、靛玉紅外，其余四種單體無明顯抑制斑馬魚胚胎血管生成效果，且有致畸、發(fā)育遲緩、毒性等作用。靛玉紅抑制斑馬魚體節(jié)血管生成效果顯著，但濃度高于100μM，亦可致畸或致死。
　　 3、與空白對照組相比，青蒿琥酯、靛玉紅能夠抑制斑馬魚胚胎體節(jié)間血管生成，而且后者呈劑量依賴性。<

17、br>　　 4、WISH、RT-PCR結果顯示，青蒿琥酯處理的斑馬魚胚胎flk1mRNA的表達水平有較輕的抑制作用，且其抑制無明顯劑量依賴關系;靛玉紅處理的轉基因斑馬魚胚胎的flk1mRNA顯著減少，且隨著藥物濃度的增加，flk1mRNA的表達隨之減少。提示:靛玉紅可能通過抑制VEGFR2與VEGF結合后的信號通路的某個環(huán)節(jié)來阻斷胞內蛋白磷酸化，從而影響VEGFR2基因的表達。
　　 綜上所述，本實驗運用轉基因斑馬魚模型，通過