斑馬魚內(nèi)毒素炎癥模型建立及中藥抗內(nèi)毒素炎癥活性篩選研究.pdf

1、研究背景：內(nèi)毒素(LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，可直接或間接引起機(jī)體發(fā)熱、代謝改變、免疫功能紊亂，多器官功能損害、休克乃至死亡等許多病理生理過程。目前針對(duì)由內(nèi)毒素觸發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征或膿毒癥的治療尚無特殊有效的措施，仍以糖皮質(zhì)激素加對(duì)癥治療為主，尋找拮抗內(nèi)毒素的措施一直是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)努力的方向。近十幾年來，從中藥及天然產(chǎn)物中尋找抗內(nèi)毒素方法亦為關(guān)注的熱點(diǎn)，一些中藥、復(fù)方或其所含成分被證明對(duì)受內(nèi)毒素攻擊的動(dòng)物有保護(hù)作用

2、。涼膈散（載宋《和劑局方》）作為溫病治療常用名方，主要用于治療感染、炎癥等。方中重用連翹，清熱解毒，以清除上焦無形之邪熱，功專量重，是為君藥。配黃芩以清胸膈郁熱;大黃瀉火通便，以蕩有形之熱于中，共為臣藥。現(xiàn)代藥理研究亦證實(shí)組成該方的主要單味藥連翹、大黃、黃芩等都有不同程度的抗內(nèi)毒素作用。
　　 目前，對(duì)急癥醫(yī)學(xué)、抗炎免疫藥物研發(fā)顯得尤為重要的是尋找合適的動(dòng)物模型進(jìn)行抗內(nèi)毒素藥物篩選。而斑馬魚對(duì)此具有豐富的前景:體小，產(chǎn)卵量高，繁

3、殖周期短，成本低;體外受精，發(fā)育全程透明，可實(shí)時(shí)觀察病原體和損傷。此外，斑馬魚屬于脊椎動(dòng)物，其免疫系統(tǒng)與人類極為相似。斑馬魚作為理想的抗內(nèi)毒素炎癥藥物篩選模型主要在于擁有先進(jìn)的基因技術(shù)和大量的轉(zhuǎn)基因系。比如，利用Tg(mpo∶GFP)系可實(shí)時(shí)活體觀測(cè)幼魚中性粒細(xì)胞的生物學(xué)行為。這是其它脊椎動(dòng)物所無法實(shí)現(xiàn)的。
　　 本文為國(guó)家自然科學(xué)基金“涼膈散對(duì)內(nèi)毒素急性肺損傷肺組織水液轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及機(jī)制研究”和廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目“涼膈解毒膠囊臨

4、床前藥理及抗內(nèi)毒素藥效評(píng)價(jià)關(guān)鍵技術(shù)研究”的部分研究工作。在前述相關(guān)研究基礎(chǔ)上，發(fā)揮斑馬魚在抗炎免疫藥理研究及藥物篩選方面的特色與優(yōu)勢(shì)，建立方便、快捷的中藥抗內(nèi)毒素活性篩選體系，并利用該體系對(duì)涼膈散方中部分成分的抗內(nèi)毒素活性進(jìn)行篩選，從轉(zhuǎn)基因系、細(xì)胞化學(xué)水平、基因水平揭示該方抗內(nèi)毒素作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 研究目的與意義：
　　 目的:建立斑馬魚內(nèi)毒素炎癥模型，探討中藥抗內(nèi)毒素炎癥活性篩選新方法，并在此基礎(chǔ)上研究涼膈散方中

5、活性成分連翹酯苷A、連翹苷、大黃素、黃芩苷對(duì)斑馬魚內(nèi)毒素炎癥模型的保護(hù)作用。
　　 意義:構(gòu)建斑馬魚內(nèi)毒素炎癥模型，為研究人類炎癥免疫疾病相關(guān)的病理生理機(jī)制及在活體內(nèi)進(jìn)行快速藥物篩選提供新的技術(shù)平臺(tái);利用馬魚內(nèi)毒素炎癥模型，建立一個(gè)介于體外初篩與哺乳動(dòng)物驗(yàn)證之間的快速、低成本的中藥抗內(nèi)毒素活性篩選新方法，具有良好應(yīng)用前景。
　　 研究方法：
　　 1.脂多糖(LPS)誘導(dǎo)斑馬魚炎癥模型的構(gòu)建
　　 1.1

6、.LPS染毒方式選擇:不同方式（浸泡、顯微注射）同樣給予相同濃度LPS，觀察炎癥表型變化;經(jīng)中性紅染色、蘇丹黑B染色觀察巨噬細(xì)胞、中性粒炎癥遷移聚集情況;使用中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚(mpo∶GFP)，結(jié)合活體成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中性粒細(xì)胞炎癥遷移過程;觀察熒光下炎癥表型變化，統(tǒng)計(jì)存活情況，比較死亡率和生存時(shí)間（Kaplan-Meier曲線法）。
　　 1.2.LPS染毒時(shí)間（魚齡）選擇:將不同發(fā)育時(shí)期的幼魚（3天、5天、6天）顯微注

7、射相同濃度LPS，統(tǒng)計(jì)存活情況，比較死亡率和生存時(shí)間（Kaplan-Meier曲線法）。
　　 1.3.LPS染毒劑量選擇:將不同濃度的LPS(0.5，0.4，0.25 mg/ml)顯微注射到一定時(shí)期的幼魚中，統(tǒng)計(jì)存活情況，比較死亡率和生存時(shí)間（Kaplan-Meier曲線法）。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行半數(shù)致死濃度LD50的測(cè)定。
　　 2.基于斑馬魚內(nèi)毒素炎癥模型的抗內(nèi)毒素中藥活性篩選及其藥效評(píng)價(jià)方法研究——連翹酯苷A、連翹苷、

8、大黃素、黃芩苷對(duì)斑馬魚內(nèi)毒素炎癥模型的保護(hù)作用
　　 將3dpf隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(PBS)、LPS組、LPS+3個(gè)不同劑量連翹酯苷A組(LPS+FA)、LPS+3個(gè)不同劑量連翹苷組(LPS+PHN)、LPS+3個(gè)不同劑量大黃素組(LPS+EDN)、LPS+3個(gè)不同劑量黃芩苷組(LPS+BAN)、地塞米松陽(yáng)性對(duì)照(LPS+DEX)。造模后，各單體以浸泡給藥方式進(jìn)行抗炎活性篩選及其藥效評(píng)價(jià):用Kaplan-Meier曲線法分析各用

9、藥組對(duì)斑馬魚存活率及生存時(shí)間的影響，據(jù)此確定給藥濃度后，重點(diǎn)觀察給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的白細(xì)胞聚集程度(轉(zhuǎn)基因系Tg(coro1α∶GFP;lyz∶Dsred)或Tg(mpo-GFP)示蹤）、中性粒細(xì)胞數(shù)量（蘇丹黑B染色后進(jìn)行中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)）及促炎介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)(RT-PCR法)。
　　 主要研究結(jié)果：
　　 1.LPS誘導(dǎo)斑馬魚炎癥模型的構(gòu)建
　　 1.1.染毒方式選擇：采用顯微注射LPS

10、到3天受精卵(dpf)的卵黃囊中（每組34條魚），發(fā)現(xiàn)注射0.5mg/ml LPS(2nl每條魚)24h后能導(dǎo)致嚴(yán)重的畸形:卵黃壞死（22.0±0.9％）、脊椎彎曲（30.7±0.2％）、心包水腫（4.6±0.5％）、心胞膜出血（12.6±0.5％）、死亡（34.0±1.5％），其中卵黃壞死、死亡是其嚴(yán)重感染的表型，且隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)，幼魚的感染更嚴(yán)重。相反，0.5mg/ml LPS浸泡組在24h內(nèi)沒觀察到任何異常表型。
　　

11、中性紅和蘇丹黑B染色結(jié)果顯示，LPS浸泡組無明顯的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集區(qū)，出現(xiàn)聚集的斑馬魚數(shù)分別占總觀察數(shù)的0％和3.3％;而LPS顯微注射組在注射位點(diǎn)卵黃囊上可觀察到巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞大量聚集，出現(xiàn)聚集的斑馬魚數(shù)分別占總觀察數(shù)的96.6％和95.5％。這兩種炎細(xì)胞在各實(shí)驗(yàn)組中的聚集率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。
　　 用Tg(mpo∶GFP)斑馬魚示蹤中性粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，LPS卵黃注射組和PBS對(duì)照組在注射2h后可觀察到中性粒細(xì)

12、胞局部彌散在卵黃囊上;6h后PBS對(duì)照組卵黃囊上的中性粒細(xì)胞開始退回血管;而LPS卵黃注射組則成團(tuán)停滯在卵黃囊上;12-16h卵黃囊上中性粒細(xì)胞成團(tuán)停滯的部位變?yōu)橐粋€(gè)邊界清晰熒光圈;18-24h卵黃囊糜爛，mpo全身信號(hào)漸弱，開始出現(xiàn)死亡。相反，LPS浸泡組在48h內(nèi)沒觀察到中性粒細(xì)胞異常遷移行為。
　　 生存分析結(jié)果顯示，卵黃囊顯微注射LPS在32h內(nèi)對(duì)斑馬魚的致死率100％，大部分在24h內(nèi)出現(xiàn)明顯的中毒表型。浸泡LPS組無

13、明顯中毒表型，45h存活率為100％;48h存活率為85.6％，剩余幼魚直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束還存活。而卵黃顯微注射PBS和正常對(duì)照組在48h存活率分別為94.4％，100％。LPS卵黃顯微注射組的斑馬魚存活率和生存時(shí)間顯著低于LPS浸泡組。
　　 1.2.LPS染毒時(shí)間（魚齡）選擇:3dpf在注射LPS后32h內(nèi)致死率為100％，5dpf、6dpf在48h內(nèi)致死率均為94％，剩余幼魚直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束還存活。而PBS對(duì)照存活率為100％。3

14、dpf、5dpf、6dpf的中位生存時(shí)間分別為20、25、36 h，3種注射時(shí)間的生存時(shí)間有顯著性差異。
　　 1.3.LPS染毒劑量選擇:隨著注射LPS濃度降低，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)胚胎致死率也隨之下降，呈劑量依賴性。LPS半數(shù)致死濃度LD50為297.611μg/ml(95％可信區(qū)間為287.711-307.331);致死濃度LD99為542.641μg/ml(95％可信區(qū)間為503.377-598.246)。
　　 2.基于斑

15、馬魚內(nèi)毒素炎癥模型的抗內(nèi)毒素中藥活性篩選及其藥效評(píng)價(jià)方法研究——連翹酯苷A、連翹苷、大黃素、黃芩苷對(duì)斑馬魚內(nèi)毒素炎癥模型的保護(hù)作用
　　 2.1.各單體給藥組對(duì)LPS感染的斑馬魚存活率的影響:與LPS模型組相比，經(jīng)2，4，8μg/ml連翹酯苷A、1，3.3，10μg/ml連翹苷、0.055，0.11，0.22μg/ml大黃素、1.25，2.5，5μg/ml黃芩苷治療均能明顯延長(zhǎng)斑馬魚生存時(shí)間，提高存活率(均有P＜0.001)，且

16、存在劑量依賴性。其中以8μg/ml連翹酯苷A，10μg/ml連翹苷，5μg/ml黃芩苷藥效較明顯，從存活率及生存時(shí)間兩方面均優(yōu)于其它濃度治療組（分別與另兩個(gè)濃度組相比，均有P＜0.05）。與另兩個(gè)濃度組相比，0.22μg/ml大黃素雖有較高的存活率和明顯延長(zhǎng)的生存時(shí)間，但僅與0.055μg/ml存在顯著性差異，與0.11μg/ml大黃素不存顯著性差異。據(jù)此，以8μg/ml連翹酯苷A，10μg/ml連翹苷，0.22μg/ml大黃素，5μg

17、/ml黃芩苷，5μg/ml地塞米松作為浸泡給藥濃度。
　　 2.2.各單體給藥組對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的白細(xì)胞炎癥聚集和組織壞死的影響:利用轉(zhuǎn)基因系或蘇丹黑B染色觀察發(fā)現(xiàn)，與白細(xì)胞明顯募集卵黃注射位點(diǎn)的LPS組相比（3度炎癥募集為主，無壞死），在注射6h后PBS陰性對(duì)照組，地塞米松，8μg/ml連翹酯苷A，10μg/ml連翹苷，0.22μg/ml大黃素，5μg/ml黃芩苷的白細(xì)胞只有少量零散分布（1-2度炎癥募集，無壞死）。注射后12 h

18、，PBS陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組相似，注射位點(diǎn)——卵黃上無或只有少數(shù)幾個(gè)炎細(xì)胞募集（1度炎癥募集，無壞死），除LPS組中白細(xì)胞大量募集卵黃外（4度炎癥募集為主，出現(xiàn)少量壞死），各單體治療組卵黃只有少量白細(xì)胞零散分布(2度炎癥募集為主)。隨著時(shí)間增加LPS組感染程度明顯加重，24h后LPS組中幾乎所有魚卵黃都呈現(xiàn)出畸形和大面積壞死（5度炎癥募集為主，嚴(yán)重壞死），各單體治療組白細(xì)胞募集雖有所增多，但注射位點(diǎn)沒出現(xiàn)壞死或只有個(gè)別魚卵黃注射位點(diǎn)出

19、現(xiàn)小面積壞死（3，4度炎癥募集為主）。
　　 2.3.各單體給藥組對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生和遷移的影響:對(duì)于PBS對(duì)照組，卵黃囊中性粒細(xì)胞數(shù)在注射后6h達(dá)峰后開始減少，12、24h卵黃上幾無中性粒細(xì)胞;而腹主動(dòng)脈中性粒細(xì)胞數(shù)于注射后6h開始增加，且總體中性粒細(xì)胞數(shù)在3h后一直保持穩(wěn)定數(shù)量。與PBS對(duì)照相比，注射LPS后1、3、6、12 h斑馬魚總體中性粒細(xì)胞數(shù)量大量增加;其中腹主動(dòng)脈中性粒細(xì)胞在1、3h大量產(chǎn)生后于6、12

20、h逐漸減少;卵黃囊的中性粒細(xì)胞數(shù)在1、3、6隨時(shí)間推移不斷增加，6h達(dá)高峰后數(shù)量開始下降，但12h時(shí)不管是總體數(shù)量還是卵黃中的數(shù)量仍高于PBS組(均有P＜0.001)。24h后LPS組中卵黃囊注射位點(diǎn)可見明顯畸形和壞死，總體中性粒細(xì)胞數(shù)、卵黃囊的中性粒細(xì)胞數(shù)及腹主動(dòng)脈的中性粒細(xì)胞數(shù)均出現(xiàn)急劇減少。在感染的早期(1-12h)，10μg/ml連翹苷，8μg/ml連翹酯苷A，0.22μg/ml大黃素，5μg/ml黃芩苷治療組對(duì)LPS所致的中性

21、粒細(xì)胞大量產(chǎn)生，激活及炎性遷移均有明顯的抑制作用。在感染的晚期(24 h)，各單體治療組均能明顯抑制中性粒細(xì)胞的大量減少和組織壞死。
　　 2.4.各單體給藥組對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的促炎介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)的影響:注射后6-24h，與PBS組相比，LPS感染的斑馬魚其IL-1β，IL-6和TNF表達(dá)均顯著增加。IL-1β對(duì)LPS感染呈現(xiàn)出速發(fā)型應(yīng)答，6hpi已高于PBS對(duì)照組13倍，18 hpi達(dá)最高值30倍。LP

22、S組的IL-6表達(dá)情況與IL-1β相似，不同的是IL-6隨著時(shí)間增加表達(dá)量不斷增加，最高值時(shí)間在24hpi。對(duì)于TNF-α，其表達(dá)水平在這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)上上調(diào)幅度不如IL-1β和IL-6大，但各時(shí)間點(diǎn)仍明顯高于PBS組。在6-18h內(nèi)，各單體治療組均能明顯抑制LPS介導(dǎo)的TNF-α，IL-1β，IL-6表達(dá)上調(diào)，而在注射后24 h則只觀察到對(duì)IL-6增加仍有抑制作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.選擇3dpf斑馬魚，以0.5mg

23、/mlLPS濃度，采用卵黃顯微注射染毒方式，可作為建立炎癥模型的參考條件;在顯微鏡下實(shí)時(shí)活體觀察LPS誘導(dǎo)的白細(xì)胞的遷移聚集情況、斑馬魚死亡率、生存時(shí)間可作為篩選抗內(nèi)毒素炎癥活性參考指標(biāo)。
　　 2.涼膈散方中活性成分連翹酯苷A、連翹苷、大黃素、黃芩苷均有抗內(nèi)毒素炎癥作用。其作用機(jī)制可能與抑制LPS激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞而減少白細(xì)胞的產(chǎn)生及炎性遷移，抑制促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)，從而調(diào)控急性炎癥反應(yīng)的進(jìn)