TRAF6基因沉默對(duì)內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)的抑制效應(yīng)研究.pdf

1、第一部分內(nèi)毒素刺激對(duì)TRAF6基因表達(dá)的影響目的：觀察內(nèi)毒素刺激對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor-associated factor-6, TRAF6)基因表達(dá)的影響，闡明內(nèi)毒素刺激與TRAF6基因表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法：RAW264.7細(xì)胞分為L(zhǎng)PS組、地塞米松組、姜黃素組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和正常對(duì)照組。LPS組以終濃度為100μg/L LPS 刺激；地塞米松組以終濃度為0.5 m

2、g/L地塞米松預(yù)處理8 h，姜黃素組以終濃度為20μmol/L姜黃素預(yù)處理8 h；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組用含DMSO (濃度<0.1％)的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，正常對(duì)照組作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照不予以任何處理。LPS 刺激2 h、4 h、8 h和16 h后，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)TRAF6蛋白表達(dá)，realtime-PCR檢測(cè)TRAF6 mRNA表達(dá)；LPS 刺激8 h時(shí)Western blot檢測(cè)TRAF6蛋白，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)內(nèi)毒素刺激對(duì)TRA

3、F6基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：小鼠RAW264.7細(xì)胞中TRAF6 mRNA的正常表達(dá)量相對(duì)較低，當(dāng)LPS 刺激4 h時(shí)，TRAF6 mRNA表達(dá)明顯增加；隨著時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)進(jìn)一步增加，至16 h時(shí)，TRAF6 mRNA表達(dá)達(dá)到高峰。用地塞米松和姜黃素干預(yù)后，TRAF6 mRNA表達(dá)量均低于同一時(shí)間LPS組(P<0.05)，但始終高于正常水平。同一時(shí)間點(diǎn)地塞米松組與姜黃素組比較無明顯差異(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組細(xì)胞TRA

4、F6 mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組無明顯變化(P>0.05)。Western blot檢測(cè)TRAF6蛋白表達(dá)，結(jié)果與TRAF6 mRNA結(jié)果相似。
　　 結(jié)論：TRAF6 mRNA及TRAF6蛋白表達(dá)與LPS刺激有明確的時(shí)效關(guān)系。
　　
　　 第二部分 TRAF6 siRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和篩選實(shí)驗(yàn)一:
　　 目的：構(gòu)建針對(duì)小鼠TRAF6基因的短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA, shRN

5、A)真核表達(dá)載體，為下一步的細(xì)胞轉(zhuǎn)染奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：在NCBI的Nucleotide 庫中檢索小鼠TRAF6 mRNA序列，應(yīng)用Invitrogen公司的在線設(shè)計(jì)軟件BLOCK-iT? RNAi Designer，針對(duì)小鼠TRAF6 mRNA設(shè)計(jì)篩選4條siRNA序列。體外合成編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA寡核苷酸單鏈，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，將相應(yīng)的雙鏈DNA被插入pGCsi-U6/GFP/Hygro質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGC

6、si-TRAF6-shRNA1、2、3、4。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli DH5α，最后以PCR法分析鑒定陽性重組質(zhì)粒并進(jìn)行DNA測(cè)序。在紫外分光光度計(jì)上OD260和OD280讀取吸光度值，檢測(cè)質(zhì)粒DNA的濃度。
　　 結(jié)果：siRNA寡核苷酸單鏈成功退火，合成雙鏈DNA模板，凝膠電泳可見，59 bpMark 處呈現(xiàn)清晰條帶。靶向TRAF6 mRNA的4種重組質(zhì)粒載體pGCsi-TRAF6-shRNA，經(jīng)酶切和DNA測(cè)序分析，s

7、hRNA編碼序列與設(shè)計(jì)的片段完全一致，證實(shí)重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。4種重組質(zhì)粒DNA OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間，質(zhì)粒DNA質(zhì)量良好，符合實(shí)驗(yàn)要求，為下一步體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 結(jié)論：靶向TRAF6基因的重組質(zhì)粒載體pGCsi-TRAF6-shRNA構(gòu)建成功，為研究TRAF6對(duì)內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。TRAF6；RNA干擾；質(zhì)粒；短發(fā)卡RNA
　　
　　 實(shí)驗(yàn)二:

8、　　 目的：將TRAF6基因特異性重組質(zhì)粒載體pGCsi-TRAF6-shRNA轉(zhuǎn)染RAW 264.7細(xì)胞，檢測(cè)TRAF6基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況，體外篩選干擾小鼠RAW264.7細(xì)胞TRAF6基因的最佳重組質(zhì)粒載體pGCsi-TRAF6-shRNA。
　　 方法：使用不同比例的DNA質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW 264.7細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，應(yīng)用MTT 法檢測(cè)轉(zhuǎn)

9、染重組質(zhì)粒pGCsi-TRAF6-shRNA后細(xì)胞活性的變化，realtime-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞TRAF6基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，體外篩選出對(duì)TRAF6基因表達(dá)具有最佳抑制效果的重組質(zhì)粒。
　　 結(jié)果：熒光顯微鏡分析轉(zhuǎn)染效率顯示，DNA(g)/Trans Fectin(L)為2:5時(shí)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率最高。MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pGCsi-TRAF6-shRNA1、2能顯著抑制RAW264.

10、7細(xì)胞的增殖活性，與正常對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)。Realtime-PCR結(jié)果顯示，pGCsi-TRAF6-shRNA1、2組細(xì)胞TRAF6 mRNA表達(dá)水平顯著降低。其中，pGCsi-TRAF6-shRNA 1對(duì)RAW264.7細(xì)胞TRAF6基因表達(dá)的抑制作用最為顯著，抑制率為65.25％，與正常對(duì)照組相比具有明顯差異(P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，pGCsi-TRAF6-shRNA1對(duì)靶基因蛋白表

11、達(dá)抑制作用最明顯，TRAF6基因蛋白表達(dá)抑制率為60.07％，與正常對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。
　　 結(jié)論：pGCsi-TRAF6-shRNA1真核表達(dá)載體可在體外高效地抑制TRAF6基因表達(dá)，為進(jìn)一步研究TRAF6基因沉默對(duì)內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)的影響奠定基礎(chǔ)。
　　
　　 第三部分
　　 目的體外研究TRAF6沉默基因?qū)AW 264.7細(xì)胞內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)的影響。
　　 方法實(shí)驗(yàn)分為5組：

12、(A)pTRAF6-shRNA1(即pGCsi-TRAF6-shRNA1)組，質(zhì)粒pTRAF6-shRNA1+LPS；(B)陽性對(duì)照組，姜黃素(20μmol/L)+LPS；(C)陰性對(duì)照組，空白質(zhì)粒+LPS；(D)空白對(duì)照組，僅予100μg/L LPS刺激；(E)正常對(duì)照組，正常培養(yǎng)不予任何處理。LPS刺激后0h、4 h、8 h和16 h，收集細(xì)胞上清，ELISA法測(cè)定上清液中TNF-α、IL-1β、TGF-β1。LPS刺激24 h后，

13、收集細(xì)胞，realtime PCR方法檢測(cè)TRAF6、IL-6、COX-2 mRNA，Western blot檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果100μg/L LPS刺激各組RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、TGF-β1表達(dá)量都明顯增加，與正常對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)，其中TNF-α、IL-1β
　　 在8 h內(nèi)達(dá)高峰，TGF-β1在16 h達(dá)高峰，說明LPS 刺激可

14、引起細(xì)胞TNF-α、IL-1β、TGF-β1分泌。將pTRAF6-shRNA1轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后，TNF-α、IL-1β、TGF-β1增長(zhǎng)率均明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.01)。Realtime PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，pTRAF6-shRNA1組IL-6、COX-2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，與正常對(duì)照組比較有顯著差異。
　　 Western blot結(jié)果表明，pTRAF6-shRNA1組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65

15、蛋白表達(dá)明顯減少。
　　 結(jié)論重組質(zhì)粒pTRAF6-shRNA可能通過抑制LPS誘導(dǎo)的NF-кB p65核轉(zhuǎn)位，降低相關(guān)炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)的分泌，抑制RAW264.7細(xì)胞內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)。
　　
　　 第四部分 TRAF6siRNA對(duì)急性肝衰竭內(nèi)毒素炎癥小鼠的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)一目的：研究經(jīng)流體力學(xué)注射、門靜脈和腹腔常規(guī)注射3種不同途徑注射GFP表達(dá)質(zhì)粒后，目的基因在小鼠肝臟的表達(dá)情況及其轉(zhuǎn)基因效率。
　　 方法

16、：將裸質(zhì)?；蛑|(zhì)體包裹的質(zhì)粒DNA分別應(yīng)用流體力學(xué)注射、門靜脈及腹腔常規(guī)注射法注入同種異體小鼠體內(nèi)，48 h后分別取血和肝組織，常規(guī)生化方法檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和總膽紅素(TB)，HE 染色檢測(cè)肝組織病理變化，新鮮組織冰凍切片觀察3種轉(zhuǎn)染途徑對(duì)質(zhì)粒DNA在小鼠肝臟的表達(dá)影響。
　　 結(jié)果：注射48 h后，腹腔常規(guī)注射組與正常組比較，ALT和TB的升高幅度較小，與流體力學(xué)注射組比較該差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且各組

17、內(nèi)脂質(zhì)體復(fù)合物組與裸質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。常規(guī)石蠟切片HE 染色顯示，HI組及PV組小鼠肝細(xì)胞輕度水腫，各組內(nèi)裸質(zhì)粒組和脂質(zhì)體復(fù)合物組之間無明顯差異。流體力學(xué)注射組及門靜脈常規(guī)注射組均可見大量綠色熒光蛋白表達(dá)，兩組的熒光表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，腹腔注射組小鼠的肝臟僅見少量的綠色熒光表達(dá)，但三組內(nèi)脂質(zhì)體/質(zhì)粒DNA復(fù)合物組綠色熒光表達(dá)量均明顯高于裸質(zhì)粒組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：應(yīng)用流體

18、力學(xué)注射及門靜脈常規(guī)注射脂質(zhì)體/質(zhì)粒DNA 復(fù)合物途徑，目的基因均在小鼠肝臟高效表達(dá)，兩種途徑無明顯差異，流體力學(xué)注射可廣泛用于肝靶向性的活體基因轉(zhuǎn)染。GFP表達(dá)質(zhì)粒；流體力學(xué)注射；門靜脈；基因治療
　　
　　 實(shí)驗(yàn)二目的：研究TRAF6 沉默基因?qū)PS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝衰竭內(nèi)毒素炎癥小鼠的作用及其可能的機(jī)制。
　　 方法：BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、急性肝衰竭(ALF)模型組、陽性對(duì)照(姜黃素

19、)組、陰性對(duì)照(空白質(zhì)粒)組和RNAi(pTRAF6-shRNA1)組。采用流體力學(xué)注射法將pTRAF6-shRNA1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠，24 h后重復(fù)注射一次。第二次注射后24 h，予LPS(20μg/kg)聯(lián)合D-氨基半乳糖(D-GalN，600mg/kg)制做急性肝衰竭內(nèi)毒素炎癥模型。觀察小鼠存活率，并于造模后16 h，采用常規(guī)生化方法血清ALT、AST，免疫組化染色檢測(cè)iNOS和NF-κB p65在肝細(xì)胞的表達(dá)；Realtime-

20、PCR檢測(cè)TRAF6、IL-6、COX-2及NF-κB p65 mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)總蛋白和細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)；造模后4、8、16 h，ELISA檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平變化。
　　 結(jié)果：熒光顯微鏡觀察顯示真核表達(dá)質(zhì)粒pTRAF6-shRNA1成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入小鼠肝組織。pTRAF6-shRNA1可明顯抑制小鼠肝組織TRAF6 mRNA和TRAF6蛋白表達(dá)(P<0.01

21、)，其中TRAF6 mRNA表達(dá)抑制率為60.13％，TRAF6蛋白抑制率為52.08％，與正常小鼠比較均有顯著性差異(P<0.01)。LPS/D-GalN 腹腔注射16 h后，小鼠血清ALT、AST水平及肝組織病理學(xué)檢測(cè)顯示造模成功。RNAi (pTRAF6-shRNA1)組小鼠72h的存活率為49.3％，高于其它組(姜黃素組為36.2％)。pTRAF6-shRNA1可明顯降低小鼠血清ALT和AST水平，與ALF模型組比較有顯著意義(

22、P<0.01)。Realtime-PCR結(jié)果顯示RNAi組小鼠IL-6、COX-2及NF-κB p65 mRNA表達(dá)下降，與ALF 模型組比較有顯著意義(P<0.01)。ELISA檢測(cè)顯示RNAi組小鼠血漿TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平上調(diào)，但始終明顯低于同時(shí)間點(diǎn)ALF 模型組，TNF-α、IL-1β于8 h達(dá)到峰值，TGF-β1于16 h達(dá)到峰值。免疫組化染色顯示RNAi組iNOS蛋白表達(dá)較ALF 模型組降低。姜黃素組與RN

23、Ai組比較無顯著差異(P>0.05)，姜黃素有降低轉(zhuǎn)氨酶，對(duì)阻止TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2及iNOS 升高有一定作用。Western blot技術(shù)顯示ALF模型組小鼠肝組織中總蛋白和胞核NF-κB p65表達(dá)均增加；pTRAF6-shRNA1組小鼠肝組織總蛋白NF-κB p65表達(dá)水平顯著高于正常組小鼠總蛋白NF-κB p65水平(P<0.01)，但較ALF 模型組比較無明顯變化(P>0.05)，胞核NF-κB p65