內(nèi)毒素與TRAM基因表達(dá)的關(guān)系及TRAM siRNA對內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)的抑制效應(yīng)研究.pdf

1、膿毒癥休克這一最嚴(yán)重的并發(fā)癥是致命性的，死亡率達(dá)30-70％。細(xì)菌內(nèi)毒素或脂多糖是誘導(dǎo)膿毒癥或失控性炎癥反應(yīng)的主要因素之一。盡管對內(nèi)毒素導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制已進(jìn)行深入研究，但新的作用機(jī)制仍在不斷探索。從分子機(jī)制上看調(diào)控內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)的靶點很多，而要選擇一個對機(jī)體影響相對較少，又能控制炎癥反應(yīng)發(fā)展成失控性炎癥反應(yīng)并具有臨床應(yīng)用前景的靶點卻困難重重。近年來，鑒定的TLR4細(xì)胞內(nèi)MyD88非依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在LPS膿毒癥中扮演重要作用，這為

2、尋找內(nèi)毒素膿毒癥治療靶點提供了新思路。TRAM是特異性針對LPS細(xì)胞內(nèi)MyD88非依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)接頭蛋白，理論上可滿足候選條件。因此，本課題選擇TRAM基因為研究對象，從以下幾方面對內(nèi)毒素與TRAM基因表達(dá)的關(guān)系及TRAMsiRNA對內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)的抑制效應(yīng)進(jìn)行初步探討。 其主要研究方法和結(jié)論如下：1.利用生物信息學(xué)技術(shù)的蛋白質(zhì)預(yù)測軟件對TRAM蛋白的二級結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞表位進(jìn)行了分析和預(yù)測，結(jié)果顯示其最可能的優(yōu)勢B細(xì)胞表位于TRAM

3、分子N-末端第216-229位之間，氨基酸序列為QSIWKETRSVSQKQ。 2.通過人工合成該氨基酸序列，免疫新西蘭大白兔，制備了兔抗小鼠TRAM蛋白多克隆抗體，并通過ELISA、細(xì)胞免疫化學(xué)染色及Westernblot檢測證實該多克隆抗體具有較高的特異性免疫原性，為后續(xù)研究準(zhǔn)備了實驗工具。 3.設(shè)計針對TRAM基因的特異性引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增特異性的TRAM基因cDNA片段，連接至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿

4、菌DH5a，重組pGME-T載體經(jīng)酶切和測序檢測證實成功。這樣構(gòu)建了熒光定量PCR檢測TRAM基因mRNA表達(dá)的外標(biāo)準(zhǔn)品。 4.采用實時熒光定量PCR(RQ-PCR)技術(shù)檢測LPS刺激小鼠RAW264.7細(xì)胞對TRAM基因表達(dá)mRNA的影響，結(jié)果顯示：在小鼠RAW264.7細(xì)胞中TRAM基因正常表達(dá)mRNA的量相對較低，約為2.51×105拷貝數(shù)；當(dāng)LPS100ng/ml刺激4h時，TRAM基因mRNA的表達(dá)明顯增加；隨著時間延

5、長其表達(dá)進(jìn)一步增加，至LPS刺激12h時，基因表達(dá)至高峰，約為3.46×106拷貝數(shù)，比正常細(xì)胞基因mRNA的表達(dá)增高了一個數(shù)量級，刺激至24h時基因表達(dá)有所下降，但仍然顯著高于對照組。Westernblotting和免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測TRAM蛋白的表達(dá)的結(jié)果與其mRNA的表達(dá)類似，其高峰在12-16h之間。用LPS不同劑量刺激細(xì)胞，Westernblot檢測可見高劑量刺激細(xì)胞表達(dá)TRAM蛋白條帶比低劑量刺激細(xì)胞產(chǎn)生蛋白條帶明顯增加。

6、這說明TRAM基因mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)與LPS刺激有明確的時效和量效關(guān)系。 5.根據(jù)siRNA設(shè)計原則設(shè)計了2條小鼠TRAM基因的特異性靶序列(每條64nt)。構(gòu)建并鑒定表達(dá)TRAMsiRNA的重組質(zhì)粒，重組pSUPER-EGFP質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)錄功能性的TRAMsiRNA。2條靶序列插入pSUPER-EGFP質(zhì)粒H1啟動子的下游。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliJM109，最后通過雙酶切和測序重組證實pSUPER-EGFP載體構(gòu)建成功

7、。 6.R-pSUPER-EGFP采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染入RAW264.7cell。經(jīng)RQ-PCR和Westernblotting檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞(R1C和R2C)TRAM基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá).結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染細(xì)胞(R1C和R2C)TRAM基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)被明顯的抑制。 7.EMSA檢測LPS刺激轉(zhuǎn)染TRAMsiRNA的細(xì)胞顯示：野生型RAW264.7細(xì)胞的NF-κB活性表達(dá)條帶明顯大于

8、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒RAW264.7細(xì)胞的條帶，提示轉(zhuǎn)染TRAMsiRNA的細(xì)胞能明顯降低NF-κB活性表達(dá)。細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示，TRAMsiRNA既可抑制促炎細(xì)胞因子(TNF-α)增高，也可抑制抗炎細(xì)胞因子(IL-1Ra)增加，并可抑制INF-β分泌。因此，TRAMsiRNA對內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制效應(yīng)。 本研究課題在細(xì)胞水平證實了TRAMsiRNA對內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制效應(yīng)，顯示siRNA是一種有效的實驗工具，并提示