杜仲抗皮膚衰老活性成分的篩選及其作用機(jī)制研究.pdf

1、杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)，是我國特有名貴經(jīng)濟(jì)樹種，具有多種功能，如抗衰老、降血壓、抗氧化、抗疲勞、抗病毒、增強(qiáng)免疫力、抗骨質(zhì)疏松癥、抗腫瘤、護(hù)肝、降血糖等。本文主要研究了杜仲中活性成分對衰老人胚皮膚成纖維細(xì)胞（ESF-1）的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為其抗皮膚老化研究奠定基礎(chǔ)。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、臜2O2和UV(UVA+UVB)模型的損傷條件進(jìn)行優(yōu)選，采用的是MTT法檢測細(xì)胞活性。發(fā)現(xiàn)劑量為4×1

2、0-4 mol·L-1的H2O2在作用3h時(shí)對細(xì)胞的損傷適度；紫外光療儀與細(xì)胞的距離固定為15cm，在照射時(shí)間為2min時(shí)對細(xì)胞的損傷適度，時(shí)間也最合適。
　　⑵對杜仲中分離得到的18種單體化合物進(jìn)行抗皮膚衰老活性的初步篩選，使用MTT法檢測細(xì)胞活性。當(dāng)化合物濃度為2×10-6 mol·L-1時(shí)，EUB-4（桃葉珊瑚苷）、ET-11（槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷）、EUB-8（槲皮素-3-O-β-

3、D-葡萄糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷）、EUB-11（槲皮素）、EUB-15（異槲皮苷）、EUB-2（車葉草苷）、EUB-17（eucommia A）共7種化合物對H2O2及UV損傷的ESF-1都有顯著保護(hù)作用。其中，EUB-4對H2O2損傷的ESF-1的保護(hù)比對UV損傷的作用更明顯；ET-11、EUB-8、EUB-11、EUB-15、EUB-2、EUB-17這6種化合物則對UV損傷的ESF-1的保護(hù)作用更顯著。
　?、菍钚?/p>

4、較好的化合物（ET-11、EUB-2、EUB-8、EUB-11、EUB-15、EUB-17）采用H2O2損傷衰老模型研究其作用機(jī)制。分別采用不同濃度藥物對ESF-1細(xì)胞進(jìn)行預(yù)保護(hù)后，采用4×10-4 mol·L-1的 H2O2建立氧化損傷衰老模型；運(yùn)用細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色法(SA-β-Gal)檢測細(xì)胞的衰老情況；用 MTT法檢測細(xì)胞活性；試劑盒法檢測細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)的含量；Elisa法

5、檢測細(xì)胞上清液中Ⅰ型膠原蛋白（COLⅠ）、Ⅰ型基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-Ⅰ）、Ⅰ型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMP-Ⅰ）的含量。與空白組比較，模型組細(xì)胞氧化損傷后 SA-β-Gal藍(lán)染率顯著升高，表明損傷模型建造成功；與模型組相比，各給藥組均能降低損傷細(xì)胞的藍(lán)染率，抗衰老活性高低順序?yàn)镋UB-17>EUB-2>EUB-11>EUB-15>EUB-8、ET-11。細(xì)胞增殖活性顯示：與模型組相比，各給藥組能顯著提高損傷細(xì)胞的活性，且24h增殖

6、作用優(yōu)于48h，EUB-17作用大于EUB-8和EUB-2優(yōu)于ET-11、EUB-15、EUB-11?？寡趸钚越Y(jié)果顯示，給藥組均能增強(qiáng)損傷細(xì)胞SOD酶的活力、降低其MDA含量，效果EUB-2>EUB-11、EUB-15>EUB-17>ET-11、EUB-8。Elisa檢測結(jié)果表明：各給藥組細(xì)胞上清液中COLⅠ含量均高于模型組，EUB-17療效最好，EUB-2次之，之后依次為 EUB-8、ET-11、EUB-15、EUB-11；可以抑制

7、損傷細(xì)胞 MMP-Ⅰ的分泌量同時(shí)提高其 TIMP-Ⅰ分泌量，作用 EUB-2> EUB-11> EUB-15、EUB-8> EUB-17、ET-11。
　?、炔捎肬V(UVA+UVB)照射損傷衰老模型研究上述6種化合物抗光老化的作用機(jī)制，其余檢測方法同H2O2氧化損傷衰老模型。與空白組比較，模型組細(xì)胞經(jīng)UV照射損傷后SA-β-Gal藍(lán)染率顯著增加，表明損傷模型建造成功；與模型組相比，各給藥組均能降低損傷細(xì)胞的藍(lán)染率，抗光老化活性高

8、低順序?yàn)镋UB-17、EUB-2>EUB-11、EUB-15>EUB-8、ET-11。細(xì)胞增殖活性顯示，與模型組相比，各給藥組能顯著提高損傷細(xì)胞的活性，48h增殖作用優(yōu)于24h，EUB-17、EUB-2作用相當(dāng)，高于ET-11、EUB-11優(yōu)于EUB-15、EUB-8?？寡趸钚越Y(jié)果顯示，給藥組均能增強(qiáng)損傷細(xì)胞SOD酶的活力、降低其MDA含量，效果EUB-2>EUB-17、ET-11>EUB-8、EUB-11、EUB-15。Elisa檢