華蟾素抗肝癌有效成分的篩選、鑒定及作用機制研究.pdf

1、華蟾素是我國傳統(tǒng)中藥材中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)陰干皮經(jīng)提取加工制成的滅菌水溶液，在我國廣泛應(yīng)用于肝癌等多種惡性腫瘤的治療。原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年呈上升趨勢，嚴重威脅著人類的健康。尋找高效、低毒副作用的藥物用于原發(fā)性肝癌的防治有著重大的臨床意義。臨床研究表明，華蟾素對預(yù)防和治療原發(fā)性肝癌具有較好的療效，在預(yù)防乙型肝炎向原發(fā)性肝癌轉(zhuǎn)變、穩(wěn)定或部分縮小肝癌病

2、灶、減輕不良反應(yīng)和提高患者生活質(zhì)量等方面發(fā)揮著獨特的優(yōu)勢，其抗腫瘤作用主要與誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。然而，華蟾素的化學(xué)成分相對復(fù)雜，抗腫瘤機制亦不明確。因此，進一步分離、純化其有效活性成分，并闡明其作用機制，對于提高華蟾素臨床用藥的準確性，以及開發(fā)新型抗腫瘤藥物均具有重大的意義。
　　 鑒于此，本研究在前期華蟾素抗腫瘤研究的基礎(chǔ)上，采用活性追蹤分離的方法，從華蟾素中篩選鑒定出兩種具有抗肝癌活性的蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類化合物，華蟾蜍精(cin

3、obufagin)和脂蟾蜍配基(resibufogenin)，通過體內(nèi)、外實驗對活性相對較好的華蟾蜍精的抗腫瘤活性及作用機制進行了初步研究，并且測定了華蟾素中這兩種蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類化合物的含量；另外，對蟾皮超臨界CO2萃取物體外抗肝癌的活性及作用機制進行了初步探討。本研究旨在為華蟾素進一步的臨床應(yīng)用及相關(guān)抗肝癌藥物的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。
　　 1華蟾素抗肝癌有效成分的篩選和鑒定目的：篩選和鑒定華蟾素中抗肝癌的有效成分。方

4、法：采用活性追蹤分離的方法對華蟾素中抗肝癌的有效成分進行篩選。采用MTT法對不同組分抑制HepG2細胞增殖的活性進行測定?；钚越M分用部位分離、硅膠柱層析、制備型TLC以及HPLC進行提取分離。采用NMR和EI-MS技術(shù)鑒定活性化合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果：通過一系列的活性追蹤分離實驗，從華蟾素中分離獲得兩個具有抗腫瘤活性的有效組分，經(jīng)TLC和HPLC檢測證實其為兩個純度較高的化合物。通過將。1HNMR、13C NMR、DEPT及EI-MS的結(jié)果與

5、現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫及已發(fā)表文獻相關(guān)數(shù)據(jù)進行比對，最終將兩個化合物分別鑒定為華蟾蜍精和脂蟾毒配基。結(jié)論：采用活性追蹤分離等方法，從華蟾素中篩選鑒定出兩個具有抗HepG2細胞增殖作用的活性化合物，華蟾蜍精和脂蟾毒配基。
　　 2華蟾蜍精體外抗肝癌活性及作用機制研究目的：對華蟾蜍精抑制HepG2細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡的機制進行研究。方法：采用MTT法對華蟾蜍精和脂蟾毒配基抑制HepG2細胞增殖的作用進行測定。采用Hoechst33258染色和

6、PI染色的方法對華蟾蜍精誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的作用進行研究。采用Western blotting的方法對凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9的表達進行檢測。結(jié)果：在0.0001 mg/mL-100 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，華蟾蜍精和脂蟾毒配基均有抑制HepG2細胞生長的作用，且呈現(xiàn)出明顯的時間和劑量依賴性。作用24 h、48 h、72 h，華蟾蜍精對HepG2細胞的IC50分別為0.56μg/mL、2

7、.29×10-3μg/mL和1.02×10-3μg/mL；而脂蟾毒配基對HepG2細胞的IC50分別為6.95μg/mL、3.59μg/mL和3.15μg/mL。Hoechst33258染色及PI染色的結(jié)果表明，華蟾蜍精在體外具有明顯的誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的作用，表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮、細胞核出現(xiàn)致密濃染或碎塊狀致密濃染等，0.04μg/mL的華蟾蜍精作用HepG2細胞24 h后，其凋亡率為22.24％。Western blotting的結(jié)

8、果顯示，蟾蜍精體可以使細胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2的蛋白表達下調(diào)，而Bax、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達上調(diào)。結(jié)論：華蟾蜍精具有明顯的體外抑制HepG2細胞增殖的作用，作用機制與誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)，受凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9調(diào)控。
　　 3華蟾蜍精對裸鼠人肝癌移植模型抗腫瘤作用的研究目的：通過建立裸鼠人肝癌(HepG2)移植模型，探討華蟾蜍精體內(nèi)抗腫瘤的活性及誘導(dǎo)細胞

9、凋亡的機制。方法：采用肝癌細胞(HepG2)皮下注射法，建立裸鼠人肝癌移植模型。待腫瘤長至約100 mm3時，將40只模型裸鼠隨機分為大、中、小劑量組(華蟾蜍精給藥組)、陽性對照組(ADM組)和陰性對照組(NS組)，每組8只。通過觀察荷瘤裸鼠食欲、精神狀況及體重變化情況，對藥物的毒性進行評價。通過測定給藥期間裸鼠腫瘤體積變化，對藥物抗腫瘤的活性進行評價。采用HE染色法，觀察裸鼠人肝癌移植模型治療后腫瘤的壞死程度。采用TUNEL染色法觀察

10、檢測了裸鼠人肝癌移植模型治療后細胞凋亡的情況。采用Western blotting的方法檢測腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9的表達情況。結(jié)果：通過將人肝細胞癌HepG2細胞接種于裸鼠腋窩皮下，成功建立了裸鼠人肝癌(HepG2)移植模型，造模成功率>95％，然后分組給予不同的藥物處理。ADM組對人肝癌移植模型裸鼠具有一定的毒副作用，而華蟾蜍精0.5mg/kg、1 mg/kg及1.5 mg/k

11、g組均無明顯毒副作用。華蟾蜍精在毒性較小的情況下，對裸鼠人肝癌移植模型的腫瘤生長具有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性。華蟾蜍精能明顯的誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡，TUNEL染色法結(jié)果顯示華蟾蜍精0.5 mg/kg、1.0 mg/kg和1.5 mg/kg組的凋亡指數(shù)分別為：6.2±1.04、8.8±1.04、13.4±1.68，且呈劑量依賴性。Western blotting結(jié)果顯示蟾蜍精體可以使細胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2的蛋白表達下調(diào)，Bax

12、，Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達上調(diào)。結(jié)論：華蟾蜍精對裸鼠人肝癌移植模型具有明顯的抗腫瘤作用，作用機制與誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)，受凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9調(diào)控。
　　 5華蟾素抗腫瘤有效成分的含量測定目的：測定華蟾素中華蟾蜍精和脂蟾毒配基的含量。方法和結(jié)果：建立了HPLC測定華蟾素中華蟾蜍精和脂蟾毒配基的方法，色譜條件為C-18色譜柱(Waters，COSMOSIL Ch

13、olester，4.6 mm×150 mm，5μm)，流動相為乙腈/水(45:55)，檢測波長296mm，流速1 mL/min，柱箱溫度40℃，上樣量10μL，在此條件下，兩峰的分離度>1.5。對上述測定方法的線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性和加樣回收率進行了檢測，結(jié)果表明華蟾蜍精、脂蟾毒配基在相關(guān)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，濃度測定值的RSD分別為1.22％和0.73％，供試品溶液在常溫條件下24 h內(nèi)相對穩(wěn)定，平均加樣回收率分別為98.2％(R

14、SD=1.76％)和100.8％(RSD=2.61％)，均符合檢測要求。采用上述色譜條件分別對3個不同批次的華蟾素濃縮液進行了檢測，以外標法計算3批樣品中華蟾蜍精和脂蟾毒配基的含量，結(jié)果顯示3批華蟾素中華蟾蜍精和脂蟾蜍配基的含量存在較大的差異，推測可能與華蟾素濃縮液儲存過程中的穩(wěn)定性或華蟾素濃縮液的質(zhì)量穩(wěn)定性有關(guān)。結(jié)論：建立了一種簡便、精確、回收率較好的測定華蟾蜍精和脂蟾毒配基含量的方法。通過測定，不同批次華蟾素中有效成分的含量存在一定

15、的差異。
　　 6蟾皮超臨界CO2萃取物SCE-TS體外抗肝癌活性及作用機制研究目的：對SCE-TS抑制HepG2細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡的機制進行研究。方法：采用高效液相色譜法測定了SCE-TS中華蟾蜍精和脂蟾蜍配基的含量，以外標法對其中華蟾蜍精和脂蟾毒配基的含量進行計算。采用MTT法對華蟾素和SCE-TS抑制HepG2細胞增殖的作用進行測定。采用Hoechst33258染色和PI染色的方法對SCE-TS誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的

16、作用進行研究。采用Western blotting的方法對凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9的表達進行檢測。結(jié)果：SCE-TS中華蟾蜍精和脂蟾蜍配基的含量分別為334.3μg/mL和1211.7μg/mL，明顯高于華蟾素。華蟾素和SCE-TS均能顯著抑制Hq3C2細胞的增殖，且呈現(xiàn)出明顯的時間和劑量依賴性。作用24 h、48 h、72 h，華蟾素對HepG2細胞的IC50以生藥蟾皮計分別為9.310

17、mg/mL、0.122 mg/mL和0.033 mg/mL；而SCE-TS對HepG2細胞的IC50以生藥蟾皮計分別為0.026 mg/mL、0.012 mg/mL和0.011 mg/mL，表明等量蟾皮提取獲得的SCE-TS中抑制HepG2細胞生長有效成分的含量明顯高于華蟾素。SCE-TS具有明顯的體外誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的作用，0.001 mg/mL、0.01 mg/mL SCE-TS作用48 h后，HepG2細胞的凋亡率分別為18